磷酸二酯酶4抑制剂罗氟司特改善认知功能研究进展

付华容，王 浩，张汉霆，2

（1.山东第一医科大学药理学研究所，山东 泰安271016；2.美国西弗吉尼亚大学医学院，摩根顿 西弗吉尼亚26506）

认知（cognition）是指通过形成概念、知觉、判断或想象等一系列心理活动来获得知识的过程，涉及语言、学习、记忆、思维、精神等一系列功能。脑组织病变或受损则会产生认知功能的损害，而损伤记忆的同时也会伴随注意力、视空间、执行功能障碍，严重影响日常工作、社交和生活能力。多种中枢神经系统（central nervous systern，CNS）疾病伴有认知功能的减退，如阿尔茨海默病（Alzheimer disease，AD）、帕金森病（Parkinson disease，PD）等［1］。多种信号通路的变化可影响认知功能。其中，cAMP 信号通路为调节认知的重要机制，可通过调控其下游一系列信号分子参与突触联系的形成而影响认知功能。

磷酸二酯酶4（phosphodiesterase-4，PDE4）为cAMP 特异性水解酶，抑制其活性可上调cAMP水平，参与认知功能的调控，是多种CNS 疾病的作用靶点，因此，PDE4 抑制剂也成为人们研发CNS保护药的焦点［2］。但多种传统PDE4抑制剂在改善认知功能的同时，具有明显的致呕吐副作用，妨碍其临床应用。因此，开发新型、有效、无副作用的PDE4 抑制剂一直是该领域的一个重要研究方向。近年来，PDE4抑制剂罗氟司特（roflumilast）成功用于临床，引起了人们极大兴趣并受到广泛关注。

罗氟司特是第二代高选择性PDE4 抑制剂。2011 年，美国食品药品监督管理局（FDA）批准其用于治疗慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD），是第一个通过FDA批准上市的PDE4 抑制剂［3］。对COPD 的治疗，与其通过特异性抑制cAMP水解发挥明显的抗炎作用有关。除抗炎作用外，也有文献报道，罗氟司特还具有降低体质量、抗糖尿病和抗肿瘤等作用［4］，而其最大的优势在于发挥作用的同时，致呕吐副作用较轻［5］。2015 年，Jabaris 等［6］研究发现，该药可逆转由双肾一夹法诱导高血压大鼠的学习和记忆功能障碍。自此，科学工作者对罗氟司特在认知功能方面的作用进行了广泛研究，发现其不但对多种动物模型认知功能具有改善作用，临床研究还发现其可改善健康志愿者及精神分裂症患者的认知功能，而其作用机制主要与cAMP、蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和cAMP 应答元件结合蛋白（cAMP response element binding protein，CREB）信号通路有关。

1 罗氟司特的理化性质及药动学

罗氟司特为苯甲酰胺类化合物，其化学名称：3-（环丙基甲氧基）-N-（3，5-二氯吡啶-4-基）-4-（二氟甲氧基）苯甲酰胺，化学式：C17H14Cl2F2N2O3，相对分子质量403.2075，为白色至淡黄褐色固体颗粒或结晶性粉末，口服绝对生物利用度为80%，可被细胞色素P450 酶（cytochrome P-450 enzyme，CYP）代谢为N-氧化物，该N-氧化物仍然具有活性，但弱于罗氟司特2～3倍。口服罗氟司特1 h后血药浓度达到峰值，而其N-氧化物在8 h 后达峰。放射标记研究发现，口服罗氟司特后，可在脑组织内监测到其浓度［7］，说明该药能穿透血脑屏障进入脑组织。Takano等［8］发现，非人灵长类动物静脉注射临床剂量的罗氟司特，可测得其与脑内PDE4蛋白结合，说明罗氟司特可入脑发挥抑制PDE4的作用。

2 罗氟司特对动物认知功能的改善作用

2.1 提高正常认知功能

咯利普兰（rolipram）是经典的PDE4 抑制剂，具有明显的促进认知作用，但由于其引起恶心、呕吐的副作用，限制了其临床应用。Vanmierlo等［9］通过研究罗氟司特和咯利普兰对7 月龄雄性C57BL/6NCrl 小鼠认知功能影响及致呕吐副作用发现，两药在0.03 mg·kg-1均可促进小鼠的学习记忆能力，但在0.1 mg·kg-1时，只有罗氟司特在Y迷宫实验中表现出促进空间记忆的作用，咯利普兰却没有；同时还发现，咯利普兰致呕吐剂量是其促进记忆剂量的10 倍，而罗氟司特则为100 倍。以上结果说明，罗氟司特在改善认知功能及减轻致呕吐副作用方面都比咯利普兰更具优势。

2.2 改善高血压诱导的认知功能障碍

高血压（hypertension）是最常见的慢性病，为脑血管病最常见和最重要的危险因素。最近研究认为，其不仅是血管性认知损害（vascular cognitive impairment，VCI）和血管性痴呆的重要原因，也是AD 的危险因素［10］。临床研究发现，高血压可导致衰老个体出现认知功能下降，而多项动物实验也证实了此观点。如老年自发高血压模型大鼠、两肾一夹法构建的高血压模型动物以及醋酸脱氧皮质酮诱发的高血压模型动物等均可出现学习记忆能力下降。目前对于高血压诱导认知功能障碍的机制还未完全阐明，可能与血压升高导致脑供血不足而诱导脑白质发生缺血性损伤有关，并且降压药对于高血压认知功能障碍的影响也存在一定的争议。而Jabaris等［6，11］在通过两肾一夹和醋酸脱氧皮质酮高血压模型诱导认知障碍的研究中发现，咯利普兰和罗氟司特虽对2 种模型动物的血压无影响，但能明显改善其认知功能，并且通过对血浆及脑组织中药物浓度的测定，得到了药动学的支持；研究中也发现，罗氟司特低剂量（0.3 mg·kg-1）给药组虽具有改善认知功能作用，但在血浆及脑组织中的药物浓度却极低，而其代谢物N-氧化物浓度却较高，说明其N-氧化物可能也具有改善认知的作用，但对于其相关作用的详细研究还未见报道。

2.3 改善Aβ诱导的认知功能损伤

β 淀粉样蛋白（beta amyloid，Aβ）是老年斑（senile plaque，SP）的主要组分，而SP 是AD 特征性的病理学改变，因此，Aβ是AD 发病的关键分子。Aβ 是机体内由β 淀粉样前体蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）生成的代谢产物。APP 是一种在脑组织内表达较高的跨膜糖蛋白，在β 分泌酶或γ 分泌酶的作用下，APP 会被分解生成Aβ40或Aβ42［12］。正常情况下，APP 处于动态平衡状态，当APP 生成和降解异常时，可导致脑内Aβ 异常沉积而聚集形成SP，引起神经元细胞凋亡、诱发炎症反应以及神经递质通道异常，最后致使行为和认知功能损伤［13］，而脑内注射Aβ42或其毒性成分Aβ25～35、APPswe转基因、APP/PS1 双转基因等基于Aβ 的干预手段均可诱导AD 发生。研究发现，罗氟司特对以上3种以Aβ为基础诱导AD模型的认知障碍均具有改善作用。本课题组及其他研究团队利用海马CA1 区内微量注射Aβ25-35诱导大鼠AD 模型发现，在水迷宫实验和避暗实验中，罗氟司特在0.2，0.4和0.8 mg·kg-1剂量下产生与咯利普兰（0.5 mg·kg-1）类似的效果，即明显改善AD大鼠的学习记忆能力，尤其是中高剂量的罗氟司特作用更明显［14-15］。同样地，APP/PS1 双转基因AD 小鼠在给予罗氟司特（0.1，0.2和0.4 mg·kg-1）后，通过新物体识别、Morris水迷宫和降压被动回避实验检测到，给予中高剂量的罗氟司特使小鼠学习记忆能力明显提高［16］。Gulisano等［17］认为，单剂量罗氟司特虽可改善学习记忆能力，但不能维持记忆持久性。给予APPswe小鼠伐地那非（uardanafil）0.1 mg·kg-1与罗氟司特0.01 mg·kg-1长期联合用药，结果发现，不仅可对抗AD，达到改善认知及空间和情境恐惧记忆的作用，也可使治疗作用更持久。伐地那非为PDE5 抑制剂，可上调环磷酸鸟苷，进而改善认知功能。

2.4 改善脑缺血再灌注诱导的认知功能损害

慢性脑低灌注（chronic cerebral hypoperfusion，CCH）是长期脑内血流逐渐地减少而处于缺血状态，在血管性痴呆和AD 等神经退行性疾病发生发展的过程中起着重要作用［18］。采用老年大鼠四血管闭塞/颈内动脉模型诱导慢性脑灌注不足，可致使大脑皮质和海马的持续性记忆缺陷以及神经元丢失［19］。Santiago等［20］研究发现，罗氟司特可明显改善CCH诱导的认知功能障碍，但对海马神经元的损伤却无缓解作用。而在七氟烷（sevoflurane）诱导海马神经元细胞损伤实验中［21］，未给予七氟烷时，罗氟司特对海马神经元细胞活力、细胞凋亡和凋亡相关蛋白的表达无影响，但可明显保护七氟烷诱导的海马神经元损伤，降低细胞凋亡。这说明罗氟司特对于神经元的保护作用可能与诱导的模型有关。

2.5 改善东莨菪碱诱导的认知功能损害

东莨菪碱（scopolamine）是一种莨菪烷生物碱类药物，具有拮抗毒蕈碱受体的作用，主要是通过阻断中枢胆碱能信号转导使学习和记忆能力受损［22］。多奈哌齐（donepezil）为乙酰胆碱酯酶抑制剂，是目前临床用于治疗AD 改善记忆功能的药物［23］。Vanmierlo 等［9］研究发现，当单独给予大鼠多奈哌齐0.1 mg·kg-1时，东莨菪碱诱导的认知缺陷不能逆转；同样，单独给予罗氟司特0.1 μg·kg-1也不能改善东莨菪碱的认知功能障碍；但当二者联用时，可完全逆转由东莨菪碱诱导的大鼠记忆功能障碍。而Gulisano 等［17］将罗氟司特联用伐地那非较好地改善小鼠学习记忆障碍。这说明恰当运用罗氟司特与其他药物联用，其改善认知的作用可被增强。另外，罗氟司特虽具有较弱的致恶心呕吐副作用，但此副作用仍然存在，是否可通过药物联用降低副作用，并保持或增强其改善认知功能的作用，还有待进一步研究。

3 罗氟司特对人类认知功能具有改善作用

罗氟司特不但可改善动物的认知功能，而且一些临床研究发现，其对人的认知功能也有一定改善作用。感觉门控（sensory gating）是大脑对感觉刺激反应的一种调节能力，属于大脑的一种正常功能，大脑能特异性抑制与输入无关、多余的感觉刺激，使大脑更高级的功能不被无关感觉刺激所超载。若感觉门控缺损，会导致无关刺激超载，最终诱发与认知、注意等有关的各种精神障碍，如精神分裂症、抑郁症、癫痫和AD 等。Heckman 等［24］研究发现，分别给予18～30 岁的健康年轻志愿者罗氟司特0.1，0.3和1 mg后，仅在0.1 mg可改善志愿者的感觉门控，而此剂量比临床批准用于治疗急性COPD的剂量低5倍，同时，在此剂量下也未观察到出现呕吐等副作用。而Van Duinen等［25］研究发现，单剂量给予罗氟司特0.1 mg，可使年轻健康受试者在口头学习任务中学习记忆能力显著高于安慰剂。Blokland等［26］研究发现，短期给予罗氟司特0.1 mg，不会损害健康老年人（60～80岁）的记忆，反而可改善其情节性记忆。除对健康老年人进行研究外，也有文献报道，一些学者正在进行与年龄相关的记忆障碍的老年人使用罗氟司特的临床研究，而此研究结果尚未公布［27］。Gilleen 等［28］对具有多种认知功能缺陷（包括学习记忆和工作记忆下降）的精神分裂症患者的研究发现，患者给予罗氟司特0.25 mg治疗后，其言语、记忆等都得到显著性改善，此剂量未观察到严重的副作用。

以上研究结果表明，罗氟司特也具有改善人类认知功能的潜能，而作为已上市药物，其对于治疗CNS 疾病更具成药的潜能，尤其是对AD 等与认知功能障碍密切相关的疾病，但仍需更加有力的AD动物模型及人体试验的研究证据。另外，作为PDE4抑制剂，仍然不可避免恶心呕吐副作用，应密切关注。

4 罗氟司特改善认知功能的机制

PDE4有4种亚型（PDE4A，B，C和D），可编码剪切成25 种不同PDE4 变异体。各亚型分布在不同脑区，PDE4A和PDE4D均在海马CA1区和齿状回高度表达；PDE4B 主要存在于下丘脑、杏仁核和纹状体；而PDE4C在CNS中表达很少，主要分布在外周［29］。这种脑内分布差异可体现其在CNS 中具有各自独特的作用。而罗氟司特对PDE4具有选择性抑制作用，表现为低浓度时高度选择性地抑制PDE4，而对其他PDE 同工酶无抑制作用。但罗氟司特对PDE4 的4 种亚型抑制作用选择性较低，表现为除对PDE4C的抑制作用较弱外，对其他3种亚型的抑制作用相当［30］。对于不同认知功能障碍模型，这种抑制作用也具有差异性。研究发现，高血压诱导认知障碍模型中，海马PDE4B和PDE4D的表达显著增加，而给予罗氟司特治疗后可明显下调PDE4B 和PDE4D 蛋白表达，而PDE4A 蛋白水平未因高血压和治疗发生改变［6，11］。PDE4 为cAMP的特异性水解酶，调节其在细胞内的水平，影响下游分子PKA 的活化和CREB的磷酸化，而磷酸化的CREB可调控参与信号转导和细胞可塑性的基因表达，如脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）和炎症因子等［31］。在多种动物模型中，罗氟司特可上调胞内cAMP 浓度，激活cAMP/PKA/CREB 信号转导途径，而达到调节认知和神经保护作用，而其下游分子包括BDNF、炎症因子等［6，11，14-17］。

4.1 脑源性神经营养因子

BDNF 广泛分布于CNS 内，对神经元的存活、分化和生长发育起重要作用。BDNF对认知功能具有关键性调控作用，可保护神经元免受损伤、增加突触可塑性、影响长时程增强［32-33］。在多个实验中发现，罗氟司特抑制PDE4 后，上调BDNF mRNA和蛋白的表达［6，11，14，17］，说明调控cAMP/CREB信号转导及其下游BDNF 的表达是罗氟司特改善认知功能的主要机制。

4.2 MEK/ERK信号分子

细胞外调节蛋白激酶（extracellular regulated protein kinase，ERK）介导的信号转导通路不仅涉及到调节机体细胞的生理功能，还参与各种神经退行性疾病的发病机制，因而在行为反应和认知方面都起着关键性作用［34］。Peng 等［21］研究发现，在七氟烷诱导海马神经元损伤实验中，给予罗氟司特1 μmol·L-1可显著性抑制细胞PDE4 蛋白表达，增加细胞培养上清液中cAMP 含量，同时上调磷酸化丝裂原活化蛋白激酶激酶（phosphorylated mitogenactivated protein kinase kinase，pMEK）和pERK蛋白表达，调节凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax的水平，减少细胞凋亡，改善神经元损伤。这些说明该药的神经保护作用也可能与MEK/ERK 信号通路有关。MEK/ERK 的上游信号分子为Raf（raf 基因编码的蛋白产物），而B-Raf 活性受PKA 的调控，同时Raf信号也受Ras（原癌基因c-ras 的表达产物）信号分子的调控，而Ras/Raf/MEK/ERK 信号通路也是调控认知功能的关键通路之一［35-36］。因此，罗氟司特对MEK/ERK通路的调控是否通过其他机制作用于Ras通路，还是通过抑制PDE4调控PKA，进而影响Raf/MEK/ERK，还有待进一步实验证实。

4.3 炎症因子

罗氟司特对COPD 的治疗主要依靠其抑制PDE4 后产生的抗炎作用。研究证实，罗氟司特可调控炎症因子如肿瘤坏死因子α、白三烯B4、白细胞介素8（interleukin 8，IL-8）、一氧化氮、髓过氧化物酶和一氧化氮合酶等而改善气道损伤［37-38］。炎症也是诱导认知功能障碍的主要机制之一。研究发现，罗氟司特改善APP/PS1双转基因小鼠的认知功能的同时，使促炎细胞因子IL-6，肿瘤坏死因子α和IL-1β及其下游信号分子NF-κB 和P65 水平均明显降低［16］。由此表明，罗氟司特改善认知功能也与其抗炎作用有关。其能否调控其他炎症因子的水平还有待进一步研究。

5 罗氟司特的其他中枢作用

5.1 调控酒精依赖

酒精依赖和酒精滥用统称为酒精饮用疾病（alcohol use disorders），是一种无节制反复饮酒造成躯体或心理方面对酒精的强烈渴求与耐受性的精神疾病。酒精饮用疾病严重危害人类健康，但目前没有理想的治疗方法。最近，本实验室采用酒精双瓶选择实验观察了罗氟司特对C57BL/6J小鼠酒精摄入和偏好的影响。结果发现，罗氟司特剂量依赖性地抑制酒精摄入量，减少酒精偏好，与咯利普兰作用类似但较弱，两者的作用与中枢机制有关，而非味觉刺激产生［39-41］。因此，罗氟司特有望用于酒精中毒或酒精依赖的治疗。

5.2 其他作用

Heckman等［42］研究发现，罗氟司特能介导多巴胺调控的运动冲动，说明其可能对注意缺陷多动障碍具有调控作用。Wu 等［43］研究发现，罗氟司特可通过抗炎作用改善蛛网膜下腔出血。Vogel等［44］研究发现，罗氟司特通过修复海马长时程增强作用可改善爆炸导致的创伤性脑损伤。Aldrich 等［45］则应用Cln3Δex7/8小鼠研究发现，罗氟司特通过改善运动、降低胶质细胞激活、提高谷氨酸转运蛋白的表达等对青少年型神经元蜡样脂褐质沉积病具有改善作用。

6 展望

综上所述，罗氟司特具有明显的改善认知功能的作用。它既可改善包括AD模型在内的多种认知障碍动物模型的认知功能，也可改善健康人和精神分裂症患者的认知功能。因此，罗氟司特可能是潜在的CNS保护药物。因其为已上市的药物，使其在治疗神经系统疾病的临床应用方面具有更好的前景。但其神经保护作用机制还有待进一步研究。