米诺环素对脊髓损伤治疗机制的研究进展

晏荣保，祁全，刘杨，赵鹏，李成勇，尹逊屹

哈尔滨医科大学附属第一医院骨科，黑龙江哈尔滨市 150001

脊髓损伤导致损伤平面以下运动、感觉和自主神经功能障碍。脊髓损伤的病理过程分为两个阶段：原发性损伤和继发性损伤。原发性损伤发生迅速且不可逆。继发性损伤的机制包括血脊髓屏障破坏、缺血再灌注损伤、细胞功能障碍、兴奋性毒性、氧化应激、自由基形成、免疫损伤以及炎症改变，其加剧细胞死亡并显著扩大损伤范围，是大多数药理学干预的主要靶点[1‑3]。

1998年，Yrjänheikki 等[4]首先在动物脑缺血模型中证实米诺环素的神经保护作用。此后许多研究者不断深入研究米诺环素在脊髓损伤动物模型和细胞培养物中的作用及机制，揭示米诺环素可能成为治疗脊髓损伤的有效药物[5‑6]。本文对米诺环素治疗脊髓损伤的研究进展进行综述。

1 米诺环素概述

米诺环素是第二代半合成四环素类抗生素，主要通过与核糖体30S 亚基结合、阻止肽链延长、抑制细菌的蛋白质合成等发挥抗炎作用。目前临床上主要用于治疗痤疮等皮肤病、性传播疾病以及类风湿性关节炎，长期使用时安全性良好。常见的副作用包括恶心、眩晕和轻微头痛，主要发生在治疗早期，停药后症状即可消失。

与第一代四环素相比，米诺环素具有更好的药物动力学特性，半衰期更长，组织渗透性更好，生物利用度更高。由于其分子量小，亲脂性高，可有效透过血脑屏障而到达中枢神经系统。

除了抗菌作用外，米诺环素还在多种神经系统疾病的实验模型，包括脑卒中、创伤性脑损伤、神经性疼痛、帕金森病、亨廷顿舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化症、阿尔茨海默病、多发性硬化症和脊髓损伤等，发挥神经保护作用[7‑10]。米诺环素相关的临床试验也取得丰硕的研究成果。

2 米诺环素治疗脊髓损伤的作用机制

2.1 抗氧化效应

脊髓损伤后细胞暴露于活性氧(reactive oxygen species,ROS)和活性氮(reactive nitrogen species,RNS)等自由基时，发生氧化损伤。高反应性ROS 和RNS 使细胞膜不稳定，损伤细胞器、蛋白质和核酸，并通过凋亡或坏死途径而导致细胞死亡。脊髓损伤后ROS 和RNS 的产生显著增加，导致存活的细胞和周围组织广泛损害，被认为是继发性损伤级联中的关键事件之一[11‑12]。

Aras等[13]在大鼠脊髓损伤后给予米诺环素，发现血液和组织样本中丙二醛(malondialdehyde,MDA)水平降低，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glu‑tathione peroxidase,GSH‑Px)水平降低，组织总抗氧化状态和总氧化状态(total antioxidant and oxidant status,TAS‑TOS)水平显著增高。这证实脊髓损伤增加氧化应激和米诺环素剂量依赖性的抗氧化活性，米诺环素可能在氧化应激诱导的组织损伤中具有治疗潜力。Sonmez 等[14]也证实脊髓损伤后使用米诺环素可显著降低丙二醛和谷胱甘肽的水平，表明米诺环素显著减少脂质过氧化。总之，抗氧化活性是米诺环素减少继发性损伤的重要机制。

2.2 抗凋亡作用

脊髓损伤后的细胞损伤是由血管痉挛、局部缺血、氧化应激和再灌注损伤等引起，凋亡是细胞死亡的重要途径。半胱天冬酶‑3(Caspase‑3)是细胞凋亡过程中最重要的蛋白酶，它是多种凋亡途径的下游效应部分，可引起一系列凋亡活动[15‑16]。

Sonmez 等[14]在大鼠脊髓损伤后给予米诺环素，使用脱氧核苷酸末端转移酶介导的脱氧尿苷三磷酸‑生物素缺口末端标记(TdT‑mediated dUTP Nick‑End Labeling,TUNEL)染色和凋亡指数值进行评估。短期评估显示，脊髓损伤组、对照组、米诺环素静脉输注组和腹腔注射组凋亡指数分别为73.33%、1.33%、10%和16.66%。长期评估也显示类似的结果(分别为70%、1%、3%和3.66%)。结果证实米诺环素能显著减少脊髓损伤后第1 天和第28 天TUNEL 染色阳性细胞的数量，这表明米诺环素的治疗在短期评估和长期评估中均能减少细胞凋亡，并且这种抗凋亡效果在长期评估中更为显著。

Chen 等[17]的研究证实，米诺环素能够抑制Caspase‑3 的活化，下调p38 丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen‑activated pro‑tein kinase,p38MAPK)的表达而发挥抗凋亡作用。米诺环素发挥抗凋亡作用的机制可能包括降低线粒体通透性转换率，减少应激条件下Ca2+的摄取，减少反应性活性物质的形成和抑制p38MAPK通路等[18‑19]。因此，米诺环素发挥抗凋亡作用而减轻继发性脊髓损伤，需要进一步的研究来证实米诺环素对凋亡通路和关键靶点的作用。

2.3 抗炎作用

炎症是脊髓损伤后继发性损伤过程的关键事件。过去，经常认为神经炎症对神经功能有害，然而近年来对小胶质细胞表型的研究强调脊髓损伤后炎症反应的复杂性[20]。

小胶质细胞作为中枢神经系统中的关键炎性细胞，在受损脊髓中其表型和功能是动态的，并且可以根据脊髓损伤后的微环境而改变。M1 型小胶质细胞表达炎性细胞因子，包括肿瘤坏死因子‑α(tumor necrosis factor‑α,TNF‑α)、白细胞介素(inter‑leukin,IL)‑1β、干扰素‑γ (interferon‑γ,IFN‑γ)、一氧化氮(nitric oxide,NO)以及细胞表面标志物CD86和CD68，促进继发性损伤。M2 型小胶质细胞表达不同的分子，如IL‑4、IL‑10、精氨酸酶1 (arignase1,Arg‑1)、类几丁质酶样分子3 (chitinase‑like 3,Ym1)和CD206，并显示出神经保护作用。脊髓损伤的微环境有利于M1 型小胶质细胞的表达，而M2 型小胶质细胞仅在脊髓损伤后的早期短暂出现[21‑23]。

Kobayashi等[24]在SOD1小鼠模型中证实米诺环素在体内和体外抑制M1 型小胶质细胞表面标志物的表达以及炎性细胞因子的产生，而不影响体内M2型小胶质细胞表面标志物的表达。这是第一个证明米诺环素在小胶质细胞亚群中选择性的研究。这项研究表明，米诺环素选择性抑制小胶质细胞活化成促炎状态，这为理解许多伴随小胶质细胞活化疾病的病理变化提供基础。

Papa等[25]在体内和体外测试和评估一种新型的纳米载体药物递送工具，即米诺环素‑聚合纳米颗粒(polymeric nanoparti‑cles,NPs)。结果表明，米诺环素‑NPs 能减少损伤部位周围的小胶质细胞活化和增殖，并有利于减少小胶质细胞M1 表型，增加M2 表型。这种新型的纳米载体药物递送工具能够增强药物靶向性，增加药理活性并减少潜在的药物相关副作用，显示出独特的优势。通过进一步研究，Papa等[26]证明米诺环素‑NPs能够有效调节小胶质细胞，从而降低促炎反应，维持促再生周围环境，促进运动功能持续改善，这说明特制的生物材料选择性递送药物是一种有前途的创新方法。

以上研究表明，脊髓损伤后给予米诺环素可抑制继发性损伤的进展，有利于减轻组织损伤和促进运动功能恢复。米诺环素的治疗机制与抗氧化活性、减少细胞凋亡、抗炎作用和选择性调节小胶质细胞的活化状态等相关。

3 临床研究

脊髓损伤动物模型中的临床前期研究结果支持米诺环素潜在的治疗作用。Casha 等[27]为了优化剂量，评估安全性和确定治疗可行性，开展米诺环素治疗脊髓损伤的单中心Ⅱ期随机对照试验。有52 例患者随机分为米诺环素治疗组和对照组，受试者12 h 内静脉输注负荷剂量800 mg，接着每12 小时依次递减100 mg，直至达到400 mg，随后维持该剂量，共7 d。从损伤当天到伤后12 个月评估神经学功能。结果显示，接受米诺环素治疗的患者比接受安慰剂患者的运动评分高6 分。在颈髓损伤患者中，观察到接受米诺环素的患者运动评分增加14 分，不完全性颈髓损伤患者运动评分最大改善22 分。胸髓损伤患者没有观察到恢复差异。感觉恢复遵循与运动恢复相似的时间过程和模式。仅有1 例患者出现肝酶升高，但无症状，在停药后迅速恢复正常。虽然这项研究并未确定米诺环素治疗脊髓损伤的疗效，但他们达到试验的目标。在这项研究中证明该治疗方案是安全可行的，并且与多种结局指标的改善倾向相关。

进一步的分析表明，首先，颈髓损伤，特别是不完全性损伤，可能从米诺环素治疗中获得最大的益处。必须考虑到人类脊髓损伤的异质性，以检测潜在的重要临床差异；其次，在这些研究中使用最敏感的结果检测是至关重要的。对于胸髓损伤的患者，美国脊髓损伤协会(American Spinal Cord Injury Asso‑ciation,ASIA)的运动评分没有差异。然而，ASIA 运动评分对胸髓损伤的临床部分恢复并不特别敏感，这表明在研究这一亚群时应使用其他替代的检测措施[28]。最后，这项研究应该作为一个大型的多中心试验的基础，可以充分揭示米诺环素潜在的临床疗效。目前，正在进行米诺环素治疗急性颈髓损伤的Ⅲ期临床试验[29]。

尽管米诺环素靶向作用于多种继发性损伤机制而具有神经保护的潜力。然而，无法将用于实验动物的高剂量转化为人类患者的可耐受剂量，这限制其临床功效。实验动物的剂量为90～135 mg/(kg·d)，1～5 d，远高于最近Ⅱ期临床试验中所使用的米诺环素剂量12～22.5 mg/(kg·d)，7 d 和标准的人体剂量3 mg/(kg·d)。

此外，米诺环素治疗的持续时间有限。已证明长期全身给予高剂量米诺环素会引起肝毒性[27]。局部释放米诺环素可使受损的脊髓组织暴露于高浓度的药物，同时延长治疗的持续时间，可避免长期全身用药可能出现的副作用。Wang 等[30]在大鼠脊髓损伤模型中，开发一种水凝胶形式的药物控制性释放系统，可注射到鞘内空间，以适当的剂量和持续时间局部释放米诺环素而不会引起额外的组织损伤。与静脉输注和腹腔注射相比，该药物释放系统在减少继发性损伤和促进运动功能恢复方面更有优势，显示出对脊髓损伤的巨大治疗潜力，也为米诺环素的临床应用提供新的途径。

4 小结与展望

目前米诺环素的动物模型大多数是不完全性胸髓损伤，而临床中胸髓损伤患者大多是完全瘫痪的[31]。特别是，大多数临床病例是颈髓损伤，而只有一小部分的临床前期研究是基于颈髓水平。颈髓与胸髓解剖、生理学和免疫反应之间的差异可能会影响脊髓损伤的病理生理学差异[32]。因此，为了验证米诺化环素在临床试验中的有效性，在基础研究时使用临床相关的动物模型是必要措施。同时，与实验动物模型相比，人类脊髓损伤患者具有更大的异质性，并且由米诺环素治疗导致的恢复不能与自发性恢复相区分。通过神经影像学或生物标志物来追踪人类脊髓中的组织学和神经功能变化是重要的措施，已经成为研究的热点之一[33‑35]。

对脊髓损伤患者采用适当的结果测量尤为重要。未来人类脊髓损伤研究需要关注最有可能显示临床益处的亚群，以防止掩盖有效的治疗。最后，生物材料学的迅猛发展催生一大批新型的药物载体工具[36‑38]，能够减少治疗中使用的药物剂量并使潜在的副作用最小化，从而优化米诺环素的临床应用，这已成为未来研究中的重要课题。

总之，米诺环素可以靶向作用于多种继发性损伤机制而促进脊髓损伤的恢复，还需要进一步的研究来确定米诺环素的治疗窗口、最佳剂量、持续时间和给药途径以使米诺环素的治疗功效最大化。在对米诺环素治疗潜力进行准确评估之前，需要更好地了解米诺环素在人体内作用的机制。我们相信，随着基础和临床研究的不断深入，米诺环素将使脊髓损伤患者受益良多。