YAP、E-cadherin和Vimentin在口腔鳞癌中的表达及临床意义

程如玉，韩 瑞，王尚华，丁 翔，丁丹丹，冯振中，徐锦程

口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma, OSCC)简称口腔鳞癌，是颌面部最常见的恶性肿瘤之一，其侵袭和转移是导致患者5年生存率较低的主要原因[1-2]。大量研究[3-4]表明上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)不仅参与正常胚胎的发育和生成，而且与肿瘤的侵袭和转移关系密切。Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)作为Hippo信号通路中起中心作用的开关蛋白，在细胞的正常发育过程中结合转录因子TEAD促进下游基因的表达，进而促进细胞增殖生长。虽然YAP在多数肿瘤中扮演着促癌基因的角色，但在某些情况下，其促调亡作用致使YAP作为促癌基因遭到质疑。YAP是否通过促进EMT进程，在OSCC侵袭和转移中发挥重要作用，目前尚无相关报道。该研究旨在通过检测YAP和EMT相关蛋白E-cadherin和Vimentin在OSCC中的表达情况，进而探究其与临床病理参数的关系，以期为OSCC相关机制研究提供参考资料。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1标本选择 收集蚌埠医学院第一附属医院口腔颌面外科2013年1月～2016年12月手术切除的经病理科完好存档的OSCC石蜡组织标本54例。要求原发部位在口腔，术前未行放疗、化疗及其他影响肿瘤的治疗，术后病理证实为OSCC。同时选择癌旁正常上皮组织标本(经扩大切除，距离癌组织边缘3 cm以上)54例作为对照组。

1.1.2病例资料 男34例，女20例；年龄28～77岁，中位年龄52岁；高分化18例，中分化18例，低分化18例；有淋巴结转移24例，无淋巴结转移30例；舌癌24例，唇癌14例，牙龈癌10例，口底癌6例；根据WHO临床分期标准分为Ⅰ期24例，Ⅱ期9例，Ⅲ期7例，Ⅳ期14例。本研究涉及的组织标本经医院伦理委员会批准，患者知情同意。

1.1.3主要试剂 兔抗人YAP多克隆抗体(ABP52720)购自武汉艾美捷科技有限公司;兔抗人 E-cadherin和Vimentin单克隆抗体(MAB-0589、MAB-0735)、即用型免疫组化 EliVisionTMplus试剂盒(KIT-9901)、DAB显色剂购自福州迈新生物技术开发有限公司。

1.2实验方法所有组织标本经4%甲醛固定，常规石蜡包埋，4～5 μm连续切片后，具体染色步骤严格按照 EliVisionTMplus/HRP免疫组化说明书进行。一抗YAP、E-cadherin及Vimentin稀释比例均为1 ∶300。磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。

1.3结果判定每张组织切片由2名病理科高年资医师在双盲下阅片。显微镜高倍视野下(×400)随机选择具有代表性的5个视野，根据周榕 等[5]、陈颖 等[6]判断标准进行评分：① 染色程度:无着色，0分；淡黄色，1分；棕黄色，2分；棕褐色，3分；② 阳性染色细胞百分比:< 5 %，0分；6%～25 %，1分；26 %～50%，2分；>50 %，3分。总评分按①×②计算，总分<3分记为阴性反应(-)，≥ 3分为阳性反应(+)。

1.4统计学处理应用SPSS 24.0软件进行统计分析。分析YAP、E-cadherin及Vimentin的表达与临床病理参数之间的关系采用χ2检验；相关性分析采用Pearson检验，检验水准为α=0.05。

2 结果

2.1YAP、E-cadherin和Vimentin在OSCC和癌旁组织中的表达YAP阳性染色主要定位于细胞核和(或)细胞质，E-cadherin阳性染色主要定位于细胞膜，Vimentin阳性染色定位于细胞质。三者在OSCC和癌旁组织中的阳性表达率组间差异有统计学意义(P<0.01),见图1、表1。

2.2YAP、E-cadherin和Vimentin的表达与OSCC临床参数的关系YAP的表达与OSCC的分化程度及有无淋巴结转移相关,差异有统计学意义(P<0.05)，而与临床分期、性别、年龄、发病部位均无关(P>0.05)。E-cadherin和Vimentin的表达与OSCC临床分期、分化程度及有无淋巴结转移相关,差异有统计学意义(P<0.05)，而与患者性别、年龄、发病部位均无关(P>0.05),见表2。

2.3YAP、E-cadherin和Vimentin在OSCC中表达的相关性相关性分析显示，YAP的表达与 E-cadherin的表达呈负相关性(r=-0.424,P=0.002)，与Vimentin表达呈正相关性(r=0.519,P=0.001)，见表3。

图1 OSCC和癌旁组织中YAP、E-cadherin和Vimentin的表达 SP×400

A、B：YAP在OSCC及癌旁组织中的表达；C、D：E-cadherin在OSCC及癌旁组织中的表达；E、F：Vimentin在OSCC及癌旁组织中的表达

表1 YAP、E-cadherin及Vimentin在OSCC和癌旁组织中的表达[n(%)]

表2 YAP、E-cadherin和Vimentin的表达与OSCC临床病理参数的关系 [n(%)]

表3 OSCC组织中YAP、E-cadherin和Vimentin的相关性分析(n)

3 讨论

EMT是指上皮样细胞表型在某些诱导因素的作用下向间质样细胞表型转化的过程。研究[7-8]表明EMT是癌细胞获得侵袭和迁移能力的首要环节。细胞经历EMT后表现出多种上皮标志物的表达下调和间质标志物的表达上调，其中以E-cadherin和Vimentin最为典型。E-cadherin仅在上皮细胞中表达，具有维持细胞极性、构建与相邻细胞及外基质间黏附连接的作用，其表达减少是癌症进展、侵袭和转移的前提条件。Vimentin稳定表达于间叶细胞，作用与E-cadherin相反，其出现预示着癌细胞发生了间叶表型转变。本研究结果显示，E-cadherin在OSCC中的表达较癌旁组织明显降低，在高分化、无淋巴结转移组高表达，在中低分化、有淋巴结转移组低表达；而Vimentin在OSCC中的表达较癌旁组织明显增高，在高分化、无淋巴结转移组低表达，在中低分化、有淋巴结转移组高表达。表明随着OSCC恶性程度的提高，癌细胞获得EMT表型,发生了EMT现象。

Hippo信号通路是高度保守的信号转导通路，YAP作为其下游的关键效应蛋白，具有促进细胞增殖、抑制细胞凋亡和促进细胞恶性转化的作用[9]。本研究结果显示：YAP在OSCC中的表达显著高于癌旁组织，YAP的阳性率与淋巴结转移、病理分级亦有相关性，与Yoshikawa et al[10]的研究结果基本相符。但与之相悖的是，YAP的阳性率与临床分期无关，这可能与样本量较少有关，有扩大样本量乃至更深一步研究的必要。除此之外，本研究结果还表明：高分化OSCC中YAP多单独表达于细胞质，而中低分化OSCC中YAP可在细胞核及细胞质中均表达。这一现象表明：不同分化的OSCC细胞内已发生分子生物学变化，而YAP可能在其中起到了重要的作用。故细胞核YAP的高表达或许可作为评判OSCC进展及预后不良的指标之一。

有文献[11-12]报道，YAP对EMT起到潜在的诱导作用。本研究结果显示，YAP的高表达伴随着E-cadherin表达的下调和Vimentin表达的上调，即YAP在OSCC中与E-cadherin的表达呈负相关性，与Vimentin的表达呈正相关性。这在一定程度上也表明了YAP可能作为诱导基因之一促进了EMT进程。其可能机制是YAP作为转录共激活因子，通过与Smad蛋白家族结合，进而激活转化生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)的活性，TGF-β合成和释放增加，导致细胞脱黏附、运动迁徙能力增强，从而促进OSCC的侵袭和转移。