金黄色葡萄球菌感染对小鼠致病机制的研究

袁 晨

（郑州工业应用技术学院，河南 郑州 451100）

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是一种人类重要的病原菌，其属于葡萄球菌属，该菌是革兰氏阳性菌的典型菌类，一旦被感染就会引起严重感染，该菌在自然界的中无处不在，金黄色葡萄球菌引起的感染占所有菌类感染的第二位.金黄色葡萄球菌的感染作为平常的感染性疾病主要包括一些皮肤组织类的感染、肺炎、肠炎、败血症等[1].金黄色葡萄球菌是目前世界卫生组织的头号难题.关于金黄色葡萄球菌的流行病学一般有几个特点而且呈现季节性的分布，一般金黄色葡萄球菌的发病周期多为春季和夏季，主要是由于这个季节的食物引起腐败变化引起中毒，症状为呕吐、发热、腹泻等[2].本研究通过金黄色葡萄球菌对小鼠致病性的实验研究，探讨该菌的致病机理.

1 材料和方法

1.1 主要材料

金黄色葡萄球菌标准株，南通恒生物科技发展有限公司；小鼠金黄色葡萄球菌分离株，实验室自制；C57BL 小鼠（20±4）g（许可证 SCXK(湘)2014-0010）SPF级，长沙天勤生物科技有限公司；溶菌酶，郑州市伟丰生物科技有限公司；琼脂糖，上海耐今实业有限公司有限公司；胶回收试剂盒，上海康朗生物科技有限公司；高盐甘露醇琼脂，南京便诊生物科技有限公司；营养肉汤培养基，南京凯恒生物科技有限公司.

1.2 主要仪器

DT-1102C型恒温摇床，上海笃特科学仪器有限公司；5424R型低温高速离心机，北京伯辉生物科技有限公司；SPX-70S型生化培养箱，广州市康恒仪器有限公司；微量加样器10-1000μL，上海力辰仪器科技有限公司；E120AⅡ型电子天平，厦门群隆仪器有限公司.

2 实验方法

将金黄色葡萄球菌菌株接种于SP平板上，在37℃在恒温培养箱中培养24h，这阶段取1ml陈旧菌液加入10ml新鲜液体肉汤培养基中继续培养，轻轻摇匀，收集混合好的培养液，采用平板表面涂布的方式计算实际被感染菌落数量.

将120只C57BL SPF级小鼠平均分成两个小组，其中Ⅰ组小鼠正常接种金黄色葡萄球菌标准株，Ⅱ组接种小鼠金黄色葡萄球菌分离株.两个组内分别平均分成6个小组，每个小组10只小鼠，每个小组小鼠进行品皮下注射接种浓度为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，并且每只 C57BL 小鼠的注射 200μL.

确定小鼠感染后，每隔3h观察一次，整体观察时间为14天，期间观察小鼠的精神状态，并且记录小鼠的外观变化、发病情况、死亡情况.并且计算小鼠的半数致死量.观察时间到14天后，处死小鼠，解剖小鼠尸体观察其内脏变化，以甲醛溶液固定，并且做成组织切片，通过革兰氏染色法进行镜检，观察其病理组织变化.

3 结果与分析

3.1 小鼠接种金黄色葡萄球菌的发病率、死亡规律以及检测结果

两组C57BL小鼠在分别接种两种金黄色葡萄球菌之后，小鼠出现症状在2天时，4天时小鼠开始出现死亡情况，死亡的高峰时段集中在6天时，在经过8天之后剩余小鼠停止死亡.实验到14天时将剩余未死亡的小鼠处死，查看其所有内脏的变化是否有明显病变.结果表明：Ⅰ组中接种金黄色葡萄球菌标准株的C57BL小鼠的发病率是70%（35/50）死亡率为54%（27/50）；Ⅱ组接种小鼠金黄色葡萄球菌分离株C57BL小鼠的发病率是90%（45/50）死亡率为 74%（37/50）.采取 SP 培养基进行选择性培养特异性的PCR扩增结果与上述两组实验的结果是相似的，所以上述两种方法均可以检测出金黄色葡萄球菌实验菌.

3.2 小鼠接种金黄色葡萄球菌的临诊状态

C57BL小鼠在接种金黄色葡萄球菌2天时，通过观察两组小鼠的状态表明大部分的小鼠精神状态较差，活动较少，饮食饮水较少，背毛耸立，肛门周围的污秽物较多并且黏性较大.随着时间的加长在第5、6天时，小鼠的病情逐渐加重，小鼠面部逐渐发青并且持续加深，小鼠腹部皮下接种的位置呈现青紫色.8天之后小鼠的状况极度衰弱，头部和面部呈现水肿状态，小鼠腹部皮下接种的位置出现病变伴随着化脓情况.最终所有小鼠聚集在一起保持静止状态，其中一些病症较为严重的小鼠出现死亡，对照组小鼠正常生活，饮食饮水正常，未出现任何症状.

3.3 小鼠接种金黄色葡萄球菌肉眼病变状态

C57BL小鼠在接种金黄色葡萄球菌之后，随着时间的延长，小鼠的各个组织出现大面积病变，其中包括脾脏水肿、肺部淤血、肝脏表面可以发现小脓包并且肿大；小鼠胸腺发生大面积淤血；肾脏出现颜色逐渐变浅水肿；小鼠胃部出现溃疡，水肿.对照组小鼠未出现任何症状，肉眼病变.

3.4 小鼠接种金黄色葡萄球菌病理组织状态

C57BL小鼠在接种金黄色葡萄球菌之后，通过14天的实验将所有未死亡的小鼠处死之后，解剖小鼠查看其各个组织的病理变化.小鼠肝脏出现大面积淤血，而且萎缩的严重；小鼠肺脏出现大面积淤血还伴随着水肿；小鼠脾脏出现坏死情况，脾脏内部平滑肌变性；小鼠肾脏出现大面积水肿，肾脏血管扩张，坏死.

3.5 小鼠接种金黄色葡萄球菌LD50的检测结果

通过将两组C57BL小鼠分别接种金黄色葡萄球菌标准株与小鼠金黄色葡萄球菌分离株之后，通过采用Karber法来计算LD50数值，我们可以按照公式Log LD50=L+d（S-0.5），其中L表示的是金黄色葡萄球菌最低浓度稀释的对数，公式中的d表示的是各个组间的距离，公式中的s表示小鼠接种金黄色葡萄球菌之后发生死亡率的比值的和.其中接种金黄色葡萄球菌标准株的C57BL小鼠的LD50的数值为4.21，接种小鼠金黄色葡萄球菌分离株的C57BL小鼠的LD50的数值为5.12.

表1 小鼠接种金黄色葡萄球菌LD50的检测结果

4 结论

通过以上结果表明，两组C57BL小鼠分别皮下腹部接种金黄色葡萄球菌标准株以及小鼠金黄色葡萄球菌分离株之后，两个菌种均可以导致C57BL小鼠死亡，但是两者的致死小鼠的周期不尽相同，首先小鼠分别皮下腹部接种金黄色葡萄球菌标准株的死亡周期为6天，而小鼠分别皮下腹部接种小鼠金黄色葡萄球菌分离株的死亡周期为4天，表明黄色葡萄球菌分离株的毒性比金黄色葡萄球菌标准株要强.

从以上结果得出，C57BL小鼠对金黄色葡萄球菌的比较敏感，这给临床制备该类疫苗提供了很好的动物模型，这对后期人工接种该类疫苗之后出现的反应症状提供了宝贵的经验和理论依据.