黄芪三七合剂改善结肠机械屏障紊乱治疗慢性肾病大鼠的初探

王露，王丽，刘晓燕，季星利，樊均明,4,5*

(1. 西南医科大学附属医院肾病内科，四川泸州 646000； 2. 西南医科大学附属中医医院中西医结合研究中心，四川泸州 646000； 3. 西南医科大学医学基础研究中心，四川泸州 646000； 4. 西南医科大学附属中医医院肾病内科，四川泸州 646000； 5. 成都医学院，成都 610000)

慢性肾病(chronic kidney disease, CKD)患者往往伴有肠道功能紊乱[1]。肠黏膜上皮紧密连接(tight Junction, TJ)可以防止环境中的病原体和有害物质入侵肠黏膜，并能阻止细胞间隙中物质的渗出，是维持肠道功能正常运行的基础屏障。TJ是位于肠黏膜上皮细胞间的一个复杂的复合蛋白质体系，主要由咬合蛋白 occludin、闭合蛋白 claudins 和连接黏附分子(junctional adhesion molecules, JAMs)三种完整的膜蛋白和闭合小环蛋白(ZO-1，ZO-2，ZO-3)等组成[2]。已有研究显示，TJ的改变对肠道屏障功能障碍及其他相关疾病的发生和发展至关重要。CKD患者的肠道炎症易感性和一些炎症因子相关，如干扰素-γ(interferon-γ, IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)以及白介素(interleukin, IL)等[2-3]。中医药治疗在肾病领域的应用有悠久的历史，中药中的黄芪[4]、当归[5]、三七[6]、大黄[7]等可用来改善肾功能，并通过固本培元、化瘀降结、通腑泄浊等改善CKD症状。黄芪三七合剂作为本课题组在临床上用于治疗CKD的一种常用药方，由黄芪、三七、当归、怀牛膝、昆布、牡蛎、大黄、川穹和丹参组成，我们通过长期临床观察已证实其对CKD治疗的有效性，并在CKD大鼠上初步验证了其对受损肾功能的明显改善作用，但确切机制不明[8]。基于肾与肠道密切相关的观点，我们提出：中药复方黄芪三七合剂可通过改善黏膜受损介导的慢性肾疾病进而治疗或延缓疾病进展的假设。拟通过动物实验，应用现代医学手段，在分子生物学水平上探究黄芪三七合剂的作用机制，为研究中医药治疗肾疾病提供现代证据，推动慢性肾疾病研究的发展，具体研究报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

6周龄雄性 SD 大鼠30只，清洁级，体重(180±20)g，所有动物由成都达硕实验动物有限公司提供【SCXK(川)2015-030】，饲养于西南医科大学实验动物中心【SYXK(川)2013-065】，大鼠分笼饲养，自然昼夜节律变化，室温(23±2)℃，相对湿度 40%～60%，自由饮水，提供充足的饲料供给。实验经西南医科大学伦理委员会批准(20170621)。

1.1.2 药物与给药

黄芪三七合剂含黄芪50 g(5.21 g/kg),三七10 g(1.04 g/kg)，当归10 g(1.04 g/kg),怀牛膝30 g(3.125 g/kg)，昆布30 g(3.125 g/kg)，牡蛎10 g(1.04 g/kg)，大黄6 g(0.625 g/kg)，川穹15 g(1.56 g/kg)，丹参15 g(1.56 g/kg)(均为生药量)。括号内为大鼠用药量，实验采用中药免煎颗粒购自西南医科大学附属中医医院中药房(批号：1711025)。按照大鼠每100 g取1.5 mL的灌胃量，用相应蒸馏水混匀药物，按1倍、2倍剂量等体积一日两次给低、高剂量组大鼠灌胃一个月。尿毒清颗粒购自康臣药业有限责任公司(批号：Z20073256)。实验用药均参照《中药药理学研究方法》按人和大鼠体重换算得出。

1.1.3 试剂与仪器

TGF-β1抗体(美国 Cell Signaling Technology公司)，α-SMA、IFN-γ和IL-6抗体(美国 Boster公司)，ZO1、Occludin、Claudin-1抗体(美国 eBioscince公司)，肌酐(Cr)试剂盒(肌氨酸氧化酶法)和尿素氮(BUN)试剂盒(脲酶法)(南京建成生物工程研究所，生产批号20180201)，高速冷冻离心机(德国 Eppendorf公司)，光学显微镜(日本 Olympus公司)，凝胶成像仪(美国 Bio-rad公司)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立

随机将SD大鼠分为假手术组(Sham)、模型组(I/R)、 黄芪三七合剂低剂量组(L-HSM)、黄芪三七合剂高剂量组(H-HSM)、尿毒清组(NDQ)5个组。正常喂养两周后，术前禁食24 h,给予45 mg / kg戊巴比妥钠麻醉，将大鼠施以右肾切除术，一周后，再次施行左肾缺血再灌注手术，缺血45 min，36.5℃，正常组只施行打开腹腔、缝合[9]。四周后分别给予黄芪三七合剂低剂量组(L-HSM)18 g/(kg·d)、黄芪三七合剂高剂量组(H-HSM)36 g/(kg·d)和尿毒清组(NDQ)1.56 g/(kg·d)灌胃处理,假手术组(Sham)、模型组(I/R)给予等体积蒸馏水灌胃，2次/日。

1.2.2 标本制备

分别于造模后第二周、第四周尾静脉采血和造模八周后采血，戊巴比妥钠溶液45 mg/kg腹腔注射麻醉后，采用一次性采血管腹主动脉采血，离心，留取上清，部分上清液送西南医科大学附属中医医院检验科检测，部分-80℃冰箱保存。采血完毕后，分别取回肠及结肠组织约4 cm，用生理盐水洗净肠内容物，勿损伤肠黏膜。用组织剪各取0.5 cm放入4%多聚甲醛固定液中固定，其余放入液氮中冻存。快速取肾，去包膜，切割成块，一部分4%多聚甲醛固定，另一部分液氮冻存。

1.3 样本检测

1.3.1 血清肌酐、尿素氮检测

将血清离心取上清按照试剂盒步骤常规操作。

1.3.2 病理染色

按常规方法制备石蜡切片后，进行常规脱蜡复水，抗原修复，封闭，一抗4℃过夜，酶标二抗37℃孵育1 h，以上步骤后均用PBS洗3次，每次5 min，DAB显色4 min，复染15 s，自来水冲洗，常规脱水、透明、封片。然后免疫组织化学染色观察肠道ZO-1、Occludin和Claudin-1蛋白的表达情况。结果采用Image-Pro Plus 6.0图像分析软件对免疫组化图片进行平均光密度检测和分析。参数平均光密度代表目的蛋白的颗粒密度。

1.3.3 Western blot

将冻存的样本组织称取10 mg放入研钵中，加入少量液氮研磨，用预冷PBS缓冲液将组织吸入EP管中，其余各组采用同样方式研磨组织。将得到的各组组织离心，4℃ 5000 r/min 5 min,得到的沉淀加入300 μL裂解液(含3 μL PMSF)，充分吹打混匀，超声5 s，冰上裂解30 min,然后离心4℃ 12 000 r/min 30 min。将得到的蛋白测浓度，加入Loding buffer后95℃煮10 min,放-20℃冻存。配置10%的分离胶，依次进行上样，电泳，转膜，5%脱脂奶粉封闭，TBST洗3次，每次5 min,孵一抗，4℃过夜，TBST洗3次，每次5 min,孵二抗，TBST洗3次，每次5 min，最后曝光,用Image J软件分析条带目的蛋白与内参蛋白的灰度值比。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组大鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)的比较

大鼠造模2周时检测其SCr和BUN均无统计学差异；4周后，I/R组SCr和BUN明显升高，SCr维持在36.67 μm/L左右，BUN维持在9.27 mmol/L左右，与Sham组相比差异有显著性；8周后，I/R组SCr和BUN仍然显著高于Sham组，H-HSM组则出现SCr和BUN降低(P< 0.05)，表明黄芪三七合剂可以有效降低SCr和BUN,改善肾功能。见表1所示。

2.2 各组大鼠肾α-SMA、TGF-ß1蛋白的表达

Western blot结果显示：与Sham组相比，α-SMA、TGF-β1蛋白在I/R组中表达明显升高(均P< 0.01)；与I/R组相比，α-SMA、TGF-β1蛋白在黄芪三七合剂治疗组表达明显降低，其中H-HSM组降低表现的更甚，差异均有显著性。如图1所示。

2.3 各组肠组织炎症因子IFN-γ和IL-6的表达

结果显示：I/R组结肠组织炎症因子IFN-γ和IL-6表达升高，表明模型组结肠处于高度炎症状态；经黄芪三七合剂治疗后，结肠组织的炎症因子IFN-γ和IL-6表达显著降低，表明黄芪三七合剂可有效降低结肠组织炎症因子表达(见图2)。

表1 大鼠造模4周和8周后大鼠血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)比较Table 1 Comparison of serum creatinine (SCr) and blood urea nitrogen(BUN) in rats of each group after 4 and 8 weeks of

注：与Sham组比较，*P< 0.05，**P< 0.01；与I/R组比较，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the sham group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the I/R group,#P< 0.05,##P< 0.01.

注：与Sham组比较，*P< 0.05，**P< 0.01；与I/R组比较，#P< 0.05，##P< 0.01,(n=5)。图2 Western blot检测各组结肠组织炎症因子IFN-γ和IL-6的表达Note. Compared with the sham group, *P< 0.05, **P< 0.01. Compared with the I/R group, #P< 0.05,##P< 0.01,(n=5).Figure 2 Expression of inflammatory cytokines IFN-γ and IL-6 in colonic tissue of each group detected by Western blot

2.4 免疫组化法检测各组结肠紧密连接蛋白ZO1、Occludin和Claudin-1的表达

采用Image-Pro Plus 6.0分析软件对免疫组化图像进行光密度检测和分析，结果如图3所示，棕色颗粒为阳性表达区域：与Sham组相比，I/R组结肠上皮ZO1、Occludin蛋白的表达降低，差异有显著性，而L-HSM、H-HSM组和NDQ组出现不同程度升高的ZO1、Occludin蛋白表达，差异有显著性，但Claudin-1蛋白的变化不明显(见图3, 表2)。

2.5 Western blot法检测各组结肠组织中ZO1、Occludin和Claudin-1蛋白的表达

采用Image J分析条带灰度值可知，与假手术组相比，模型组结肠组织紧密连接蛋白ZO1、Occludin和Claudin-1表达均降低，且差异有显著性(P值分别为0.007、0.005和0.042)；而L-HSM组、H-HSM组和NDQ组均可不同程度的升高ZO-1和Occludin蛋白的表达，差异均有统计学意义。如图4所示。

表2 各组结肠紧密连接蛋白ZO1、Occludin和Claudin-1的表达比较Table 2 Comparison of the expression of colonic tight junction proteins ZO-1, occludin, and claudin-1 in each group n=5)

注：与Sham组比较，*P< 0.05，**P< 0.01； 与I/R组比较，#P< 0.05，##P< 0.01。

Note. Compared with the sham group,*P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the I/R group,#P< 0.05,##P< 0.01.

注：与Sham组比较，*P< 0.05，**P< 0.01；与I/R组比较，#P< 0.05，##P< 0.01。图3 各组结肠紧密连接蛋白ZO1、Occludin和Claudin-1的表达(IHC，×200)Note. Compared with the sham group, *P< 0.05,**P< 0.01. Compared with the I/R group, #P< 0.05, ##P< 0.01.Figure 3 Expression of colonic tight junction proteins ZO-1, occludin, and claudin-1 in each group (IHC, ×200)

注：与sham组比较：*P< 0.05，**P< 0.01；与I/R组比较：#P< 0.05，##P< 0.01，(n=5)。图4 Western blot检测各组结肠紧密连接蛋白ZO1、Occludin和Claudin-1的表达Note. Compared with the sham group, *P< 0.05, **P< 0.01. Compared with the I/R group, #P< 0.05, ##P< 0.01，(n=5).Figure 4 Expression of colonic tight junction proteins ZO-1, occludin, and claudin-1 detected by Western blot

3 讨论

CKD是世界范围内的一个重大公共卫生问题，主要是由于肾小球硬化和肾间质纤维化导致肾功能降低[10]。肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)的降低与肾间质纤维化密切相关，故与肾纤维化发生、发展相关靶向因子和介导因子是延缓肾功能恶化和改善预后的关键环节[11]。多项研究表示，改善肠道微环境可以减少血液中对肾有害的生物因子，而机械屏障是维持肠上皮的选择通透性及屏障功能的结构基础，主要是上皮细胞顶端的TJ发挥作用[12]。本课题组在前期研究中发现肠道微环境与CKD相关，但具体机制不明。本研究将从保护肠道机械屏障角度出发，进一步探讨黄芪三七合剂治疗CKD的可能作用机制。

黄芪三七合剂为本课题组临床上长期用于治疗CKD患者的复方制剂[8]，以含益气补肾、健脾活血的黄芪、当归为君药，以三七粉、昆布、大黄、牡蛎为臣药，有丹参、川穹为佐药，加上牛膝为使药，引血下行，引药入肾，此方“简、便、廉、验”。研究结果显示，黄芪三七合剂和尿毒清颗粒不仅具有降低CKD大鼠SCr、BUN的作用，还可以减轻肾组织α-SMA、TGF-β1蛋白的表达，其中尤以黄芪三七合剂的改善作用更为显著，表明黄芪三七合剂可以恢复受损的CKD大鼠肾功能并防治肾纤维化。

中医治疗注重全身阴阳平衡及脏腑功能协调，提高机体免疫力，改善体质，以扶正祛邪。慢性肾病可以引起肠道黏膜处于炎症状态，导致紧密连接蛋白表达降低，肠道机械屏障结构功能紊乱，使肠道内菌群失调和酸碱失衡，最后加速慢性肾病的进展[1-2, 13]。那么，通过减轻肠道炎症状态，纠正机械屏障紧密连接的结构紊乱，是否可以达到治疗CKD大鼠的效果？我们的实验结果显示，黄芪三七合剂确实可以降低结肠炎症因子IFN-γ和IL-6的表达，升高CKD大鼠结肠紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达，提示黄芪三七合剂治疗CKD的作用可能与其改善肠道屏障结构紊乱相关。模型组紧密连接蛋白的改变以ZO-1和Occludin为主，其中又以ZO-1蛋白的变化最明显，可能是由于ZO-1蛋白在紧密连接中扮演锚的角色供膜蛋白附着，起着关键性作用[14-15]。该结果符合大多数研究结果[12, 16-17]。

Kaori Morimoto等[18-19]研究表示，CKD患者肠道会代偿性参与多种尿毒症毒素的代谢，如硫酸吲哚酯、有机阴离子和尿酸，同时也会造成肠道失代偿，加重CKD的进展。有研究显示这可能与肠道微生物有关[20]。而CKD可导致患者肠道处于微炎症状态和机械屏障功能障碍，进而引起肠道菌群紊乱，而肠道菌群产生的短链脂肪酸(乙酸、丙酸和丁酸)可以改善受损肾功能，具体机制可能与短链脂肪酸调节表观遗传有关[19, 21]。本实验通过黄芪三七合剂改善肠道微炎症状态和机械屏障功能障碍可能缓解尿毒症毒素对肠道的损害和逆转肠道菌群紊乱，进而有效排出尿毒症毒素和产生对肾有保护作用的短链脂肪酸，可能为黄芪三七合剂改善受损肾功能的重要机制之一，也是下步我们重点研究探讨的方向。

此外，在本实验中建立的CKD 动物模型，是参照Shinozaki等[9]创建的方法，通过右肾切除左肾缺血再灌注建立CKD模型，不同于常规CKD造模方法，该模型能很好模拟CKD发病过程，更贴近由急性肾损伤(acute kidney injury，AKI)导致的CKD疾病。在设置黄芪三七合剂剂量分组时，预实验显示，低浓度便能明显改善CKD大鼠肾功能下降和肾纤维化，所以设置低剂量组和高剂量组足以说明实验结果,文中表1、表3可以看出高低剂量组存在差异，说明在改善TJ体系蛋白因子是有差异。

综上所述，黄芪三七合剂可有效改善慢性肾病大鼠肾功能，减轻肾纤维化，其作用可能与纠正结肠机械屏障结构紊乱、减少炎症因子表达有关。