葛根素治疗骨质疏松症相关分子机制研究进展

丁聚贤谢兴文许伟李宁李鼎鹏黄晋潘鑫戊宋敏苏积亮宋学文

1. 甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000 2. 甘肃省中医药研究院，甘肃 兰州 730050 3. 甘肃省中医院，甘肃 兰州 730050

骨质疏松症(osteoporsis，OP)是以全身性骨量减少、骨脆性增加、易发生骨折为特征的全身代谢性骨病[1]。我国骨质疏松的总患病率为6.6%～19.3%，平均为13%，其中约20%的患者会发生骨质疏松性骨折[2]。OP患者因其自身骨基质含量减少，骨密度(bone mineral density，BMD)降低，骨强度下降，骨皮质变薄，骨小梁减少，受到轻微暴力即可发生骨折。有研究表明[3-5]，I型胶原纤维A1基因结构区的突变、维生素D受体基因多态性的表达、雌激素受体基因型的表达、低密度脂蛋白受体相关蛋白5基因的突变、骨保护素(osteoprotegerin，OPG)遗传多态性及血清神经生长因子水平的下降均会导致骨强度降低而增加脆性骨折的风险，其严重影响着OP患者的生活质量。因此对于OP患者来说，在骨折发生前的防治尤为重要。近年来，葛根的主要有效成分葛根素凭借其具有的类雌激素效应在骨质疏松症的治疗中取得了较好的疗效，越来越多的作用靶点及分子机制被阐明。本文将从影响OP的相关分子通路与葛根治疗OP的相关分子机制方面进行综述，旨在为临床运用葛根治疗OP提供方法和思路。

1 调控骨质疏松症发生发展的常见通路及相关分子机制

1.1 调节成骨细胞增殖及分化的相关分子机制

生理状态下，在骨的生长周期中，参与骨形成的成骨细胞(osteoblast，OB)与骨吸收的破骨细胞(osteoclast，OC)始终处于动态平衡、不断重建的过程。当破骨作用大于成骨作用时会导致OP的发生。任何影响骨细胞代谢的机制均会导致骨代谢紊乱，从而导致OP的发生，此类机制也成为了防治骨质疏松的入手点。较早进行研究的Ca、P元素代谢主要是通过促进OB增殖及分化，抑制OC的生成及活性来调节骨代谢[6]。近年来，许多影响骨细胞代谢的信号通路及小分子机制不断被阐明，且某些机制互相作用并影响。RANKL/RANK/OPG对维持OB和OC的平衡有着重大意义，与OP的发生、发展有着密切的关系[7]。Ca2+信号转导途径参与调控RANKL诱导的OC的活化及分化过程，也参与调控OPG对OC分化与活化的抑制[8]。

核因子KB(NF-kB)在骨重塑上具有重要的作用，参与着细胞的生长、分化等基因表达调控[9]。有研究认为[10-11]，生长转化因子-β(TGF-β)在骨重建中能够促进成骨分化，增强骨密度，抑制OC的活性，促进OB成熟。其中TGF-β1是骨代谢重要的偶联因子。骨形成蛋白-2(BMP-2)具有诱导OB分化作用，是调节骨代谢的重要因子[10]。碱性磷酸酶(ALP)则是细胞早期矿化阶段的主要标志[12]。Smad2、Smad3[13]作为TGF-β1信号转导通路中的信号分子，其活性间接影响着骨的形成、重塑及矿化过程。Runx2[14]有促成骨效应，可诱导BMSCs发育为OB，缺失将导致骨发育不良。同时研究发现[15]，miR-204负调节Runx2而抑制成骨细胞基因的表达。Wnt/β-catenin信号通路与骨骼发育、成熟、重建有重要作用，其主要通过调控OB定向分化及特异基因的表达，增强OB活性，促进细胞外基质的矿化过程[16]。有研究显示[17]，Wnt/β-catenin信号通路可通过RANK/RANKL/OPG 信号通路抑制骨吸收，可能与β-catenin能够上调成骨细胞表达OPG有关。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族信号转导途径参与细胞生长、分化、凋亡等多种生理过程，能通过传导胞外信号至胞内及其核内，激活转录因子，调节基因表达[18]，可能与其增加钙沉积、诱导ALP的表达有关。近年研究发现[19]，其家族成员ERK1/2在OB的增殖分化中发挥重要作用。PTH信号转导通路既可促OB生成又抑制其凋亡，从而促进骨形成代谢[20]，其主要机制是与受体(PTHR)结合后通过解离破骨复合物[21]并会激活Wnt信号通路来促进骨的合成代谢。

1.2 调节破骨细胞凋亡的相关分子机制

介导OC生成的细胞因子有RANKL、TNFα、IL-6、TGFβ、IGF I、IGF II等[22]。TNFα相关因子RANKL可诱导单核细胞分化为成熟OC，TNFα可通过MEK/ERK信号通路来抑制OC的调亡[23]。TGFβ可通过调节抗酒石酸酸性磷酸酶活性抑制OC的骨吸收功能[24]。IL-6 能提高OC活性并参与介导机体雌激素水平的下调，IGF I、IGF II在所有肿瘤标本的基质细胞中均有很强的表达[25]。若缺失此类细胞因子，可出现破骨细胞合成障碍。OPG[26]是一种由OB分泌的糖蛋白，既能促进成骨细胞的分化，也可抑制破骨细胞的分化与合成，是抑制破骨细胞分化的关键因子，其基因多态性与骨强度有着密切关系。孙自强[27]研究发现AKT/mTOR/ULK1信号通路介导APG调控OC自噬并增强自噬水平。ULK1可促进自噬小体的形成，AKT参与着多种细胞增殖、分化的调节，mTOR参与OC的生成。研究发现[28]，抑制AKT的磷酸化或mTOR活性均会抑制OC的分化和骨吸收。PPAR家族成员PPAR-γ通过直接调控骨细胞的分化而抑制OB活性，促进破骨细胞形成，可能与Wnt 信号通路抑制有关[29]。PI3K/AKT/FoXO信号转导通路主要通过对下游多种增殖和凋亡相关靶基因(Bmi、Bax、CytC、AIF、Caspase-3为参与增值与凋亡的关键基因)的调控以及对Wnt/β-catenin通路的抑制来介导细胞代谢过程[30-31]。其通道最终通过影响FoxOh系列分子的活性而抑制相关下游靶基因[32]，进而介导成骨细胞增殖，破骨细胞凋亡过程。

2 葛根治疗OP的相关分子机制

2.1 葛根素促进成骨分化的分子机制研究

葛根主要功能成分包括异黄酮类化合物、葛根甙类化合物、三萜皂甙等，其中异黄酮类化合物是葛根的主要有效活性成分[33]。葛根素又称为葛根黄酮，是葛根提取物中粗异黄酮中的主要单体成分，分子式：C21H20O9，是天然的植物性雌激素。

钱康琦等[34]利用Western Bloting方法检测葛根素提取液对OB 的TGF-β1、Smad2、Smad3基因表达，发现葛根素可以抑制TGF-β1蛋白与Smad2/3蛋白的表达，表明临床运用的葛根素可以通过抑制TGF-P1与Smad2/3基因表达来抗OP。张莹莹[35]的研究发现过表达miRNA-204可下调Runx2的蛋白表达，葛根素可通过下调miRNA-204来上调成骨细胞Runx2的表达、促进成骨细胞的增殖和分化。曾祥伟[36]的研究显示，葛根素可以可提高Runx2的表达，同时通过抑制TRPM3的表达来调节细胞内外的Ca2+浓度，促进OB的增殖、分化及矿化。路立花等[13]发现葛根素通过升高BMP-2的表达水平，活化ALP活性，从而促进生物矿化。李海[37]研究发现葛根素能使去卵巢大鼠血钙、血磷和ALP基本恢复正常，可以起到促进矿化的作用。王晓晖等[38]研究发现在高糖情况下，成骨细胞的增殖、分化和Ⅰ型胶原mRNA表达处于抑制状态，但加入葛根素后能提高成骨细胞的增殖、分化和Ⅰ型胶原表达，证明葛根素对糖尿病骨质疏松症有治疗作用。王昌等[39]研究了葛根素对氧化应激后OB的影响，发现葛根素对氧化损伤的OB具有抗氧化和清除氧自由基，增加OB增殖、分化和矿化功能的作用。吕海宏等[40]用葛根素培养液培养OB，检测ERα mRNA表达及细胞增值率，发现葛根素能促进成骨细胞增殖，提髙ALP活性，可能与抑制雌激素受体α(ERα)启动子甲基化、增加ERα mRNA的表达有关。胡洪生等[30]的体外实验研究发现，葛根素能够增强OB内PI3K/AKT/FoXO信号通路的活性，抑制OB内凋亡基因的表达量，促进OB的增殖。康鑫等[41]研究发现葛根素能够促进ERK1/2蛋白的磷酸化，促进成骨细胞增殖周期转变，并且能提高细胞周期蛋白cyclin D1和CDK4 的表达。由此可见，葛根素在促进OB增殖、分化、成熟、骨矿化等方面有着多通络、多靶点、以及多通络协调作用。

2.2 葛根素抑制破骨活性的分子机制研究

袁斯远等[42]应用葛根素对破骨前驱细胞RAW 264.7进行干预，观察葛根素对体外培养破骨细胞形成以及成骨细胞OPG、RANKL mRNA表达的影响。发现葛根素能够抑制RAW 264.7诱导破骨细胞的形成，且能够通过作用于成骨细胞MC3T3-E1上调OPG mRNA和下调RANKL mRNA的表达间接调控破骨细胞。黄漫华等[43]通过观察葛根素对破骨细胞自噬相关蛋白(LC3和p62蛋白)和AKT-mTOR信号通路相关蛋白(AKT、p-AKT)表达的影响，证明葛根素能有效促进破骨细胞内的自噬相关蛋白的表达。早期已证实p62是自噬活性的有效标记蛋白，但AKT-mTOR信号通路是否为其有效的通路，仍需后期实验佐证。

2.3 葛根素调控脂代谢的分子机制研究

王珣[44]通过体外试验研究绝经后大鼠脂肪来源干细胞(ADSCs)的成骨分化能力，采用含葛根素的培养液进行ADSCs的培养诱导，通过ALP检测、茜素红染色，发现葛根素具有体外促进 ADSCs 成骨分化的效能，且无毒剂量下其成骨分化效能与浓度呈正相关，12 μmol/mL 时为最大有效的无毒剂量。齐振熙等[45]研究发现中等剂量葛根素可能通过上调Wnt/β-catenin信号传导通路的关键因子Wnt 10b mRNA及β-catenin蛋白的表达，或降低GSK3β mRNA的表达从而间接抑制激素诱导骨髓间充质干细胞向成脂分化，多应用于激素性股骨头坏死的治疗，但具体作用机制尚未阐明。也有研究显示[9,46]，低剂量的葛根素可通过AKT途径Ser473蛋白的磷酸化促进3T3-L1前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞分化。由此可见，不同剂量下的葛根素可以抑制激素诱导的骨髓间充质干细胞向成脂分化，也可以促进成熟脂肪细胞分化，这也提醒我们，从调节脂代谢来影响骨细胞代谢，可能会是葛根素治疗OP的另一条机制。

3 结语

骨质疏松症是我国乃至全世界老年人骨折、骨痛的首要原因。其发病因素多、进程缓慢、后期多并发承重骨的脆性骨折，以脊椎、股骨颈、股骨粗隆、肋骨骨折较为常见。目前临床治疗 OP的西药主要有抑制骨吸收类(雌激素、双膦酸盐类、降钙素等)和促进骨形成类(氟化钠、他汀类、雄激素、PTH)以及含维生素D的衍生物三大类。葛根素为中药葛根的三大成分异黄酮类化合物的单体提取物。影响OP的通路与分子机制较多，因此也成为了治疗OP的有效着手点。上述大量实验研究证明，葛根素在OB和OC的代谢中可以通过多种转导通路、作用于多个靶点来调节骨合成代谢以对抗OP。同时，据上述研究也发现葛根素在脂代谢调节途径中可间接抑制激素诱导骨髓间充质干细胞向成脂分化，并可促进ADSCs向成骨分化，提示调整脂代谢可能也会是葛根素治疗OP的另一种作用途径。葛根素治疗OP 的研究目前主要以实验为主，临床试验研究较少，因此缺乏大样本、多中心的临床对照研究，且有数据表明葛根素可以引起发热、变态反应、药疹、过敏性休克，甚至溶血、肝肾功能损害等毒副反应[47]，提示研究人员在今后的研究中要逐渐倾向于临床应用及不良事件的排除，令葛根素成为治疗OP安全、高效的中药提取物。