针刺对功能性便秘肠神经-Cajal间质细胞-平滑肌细胞网络影响的实验研究探讨*

文 钱，曹 洋，孙 冰，姜 鹏，娄必丹，钟 峰

(湖南中医药大学，湖南 长沙 410007)

功能性便秘(Functional constipation，FC)是功能性肠病的一种，表现为持续的排便困难、排便次数减少或排便不尽感，且不符合肠易激综合征(Irritable bowel syndrome，IBS)的诊断标准[1]。按结肠动力学特性和肛门直肠功能的改变，FC可分为慢传输型便秘(Slow transit constipation,STC)、出口梗阻型便秘(Outlet obstructive constipation，OOC)和混合型便秘(Mixture Constipation，MIX)[2]。流行病学资料显示全球受FC困扰的约占7.0%～19.0%，平均16.0%[3]，我国的发病率约为10%～15%，其中由于结肠传输功能紊乱而导致[4-5]的STC占45.5%[6]，是FC最常见的类型。目前，研究发现胃肠道运动形式主要取决于其内在的电活动，慢波作为胃肠道肌电活动的起步电位，是胃肠道平滑肌收缩的关键，是胃肠动力的基础[7]。而Cajal间质细胞(ICC)具有独立功能，能产生慢波并传导电活动，是胃肠道慢波活动的起搏和调节细胞[8-9]。多项文献研究[10-12]发现,肠道内ICC胞体多与肠神经系统(ENS)中神经末梢和神经束相伴存在、联系密切，形成突触样连接，临近的ICC之间也形成缝隙连接，而且，大量ICC突起与平滑肌细胞(SMC)亦可见缝隙连接。这种由缝隙连接形成的完整的ENS-ICC-SMC网络结构在调节胃肠运动时起重要作用，是胃肠动力的基本功能单位。另外，有研究证实，当脾气虚时针刺足三里穴及天枢穴能够减轻肠神经、ICC超微结构及SMC形态结构的损坏，维持ENS-ICC-SMC网络结构基本完整，有效增强小肠平滑肌收缩或舒张活动，保护胃肠动力[13]。研究表明针刺可能通过调控ENS-ICC-SMC网络结构改善胃肠动力。FC属于消化道常见疾病，导致FC的主要因素亦是肠道动力障碍。针刺作为传统医学中一种非药物治疗的“绿色疗法”，对治疗FC疗效显著。本研究就针刺对功能性便秘ENS-ICC-SMC网络影响的实验研究进展综述如下。

1 针刺对ENS的调控

1.1 ENS与功能性便秘的关系

胃肠道的神经调节包括中枢调节(Central regulation system，CNS)、自主神经调节(Autonomic regulation system，ANS)和肠神经调节系统(Enteric nervous system，ENS)。其中胃肠道运动功能主要由ENS调节，主要体现在肠道的蠕动反射能在离体条件下进行，由一系列基因敲除的小鼠可见，切断交感神经或迷走神经对胃肠道运动的影响较小，而ENS的功能异常或缺乏，则可引起胃肠道功能紊乱，存活率极低[14]。ENS由大量神经元、神经节细胞和神经纤维组成，它与ENS神经元分泌的大量的神经递质共同形成一个完整的、相对独立的胃肠道网络系统。在控制胃肠肌肉收缩、传输功能和黏膜内血流方面起着重要作用，通过迷走神经和交感神经来监控和调节消化道的功能[15]。有人在实验中发现,STC患者的肠神经节减少，还认为结肠组织神经元减少可能与肠神经元凋亡增加有关[16]。Hanani等[17]研究不同年龄STC患者肠肌间神经节时发现神经退行性变增多、正常神经节减少与年龄变化有关，这可能导致结肠动力紊乱。研究发现,STC患者平均每个肠段的神经元数量、神经节面积以及平均每个神经节中神经元的数量在肌间神经丛和深部黏膜下神经丛都显著减少[18]。Wattchow等[19]发现,空白对照组比STC患者结肠肌间神经丛中乙酰胆碱能神经元所占的百分比高，在STC患者的结肠内的Ach合成和释放则会减少。

因此，FC的ENS的功能状态主要受肠神经节细胞、肠肌间神经丛及神经递质等多种通路的影响，从而综合调控FC。

1.2 针刺对肠神经节细胞及肠肌间神经丛的影响

王凯悦等[20]研究发现,在空肠段巨虚组、天枢组及大肠俞组环纵肌间神经丛神经节细胞阳性表达较模型组有所上升，3组神经节细胞空泡样改变均有所恢复，在回肠段，上巨虚组及大肠俞组环纵肌间神经丛神经节细胞阳性表达较模型组有所上升且神经节细胞空泡样改变有所好转，而天枢组有所下降，空泡样表现未恢复。在空肠段，针刺上巨虚、天枢及大肠俞对便秘小鼠神经元标志物PGP9.5阳性表达的效应方向为一致性促进作用，而在回肠段，针刺上巨虚、大肠俞表现为促进，针刺天枢则表现为抑制。张微[21]研究表明，在疾病状态下，针刺大肠俞募穴可能通过促使EGC分泌产生GDNF，调控PI3K-Akt信号通路，下调mTOR的表达，抑制细胞凋亡，进而使肌层内肌间神经丛数量增多，神经细胞排列整齐及改善胃肠传输功能以治疗FC。丁曙晴等[22]研究发现,泻剂引起的便秘可引起大鼠肠神经系统肌间神经系统破坏，体现为肌肉断裂、空泡和神经元标志物表达下降，停用刺激性泻剂灌胃一段时间后已不能自然恢复到正常状态，予以针刺治疗对该便秘模型大鼠肠神经节功能恢复具有促进作用。

以上研究表明，针刺治疗FC对肠神经节细胞及肠肌间神经丛的调控，绝大部分是起促进作用，但因选穴以及肠段的不同，亦有可能表现对肠神经节细胞及肠肌间神经丛起抑制作用，这有待进一步验证。

1.3 针刺对肠神经递质的影响

ENS中有许多的肠神经递质，主要分为兴奋性调节肽(如P物质SP、乙酰胆碱ACh及胃泌素GAS等)和抑制性调节肽(血管活性肠肽VIP、生长抑素SS及NO等)两类[23-24]，参与FC中一些生化信号传导通路，承担着神经与神经、神经与肌肉之间复杂的生化信号传递任务，是肠道生化信号传导的重要载体。若兴奋性递质表达减少，抑制性递质表达增加，则会导致肠道运动受到抑制，出现或加重FC。孙彦辉等[25]实验发现,STC大鼠结肠SP、VIP阳性表达较正常组明显降低，针刺和温针灸均能明显提高结肠SP、VIP阳性表达面积，且温针灸在提高结肠SP阳性表达面积上效果优于单纯针刺，表明针灸治疗STC有效，其机制与提高结肠SP、VIP阳性表达有关，而温针灸效果更好。阮婴丹等[26]应用电针可促进STC型小鼠肠道分泌相应的脑肠肽，以维持胃肠道兴奋性递质SP和抑制性递质SS之间的平衡，即恢复其正常的化学性调控，从而改善胃肠动力障碍。有研究通过对大鼠血清中SS测定，发现模型组大鼠血清中SS含量明显升高，针刺组大鼠血清SS含量与空白对照组差异无统计学意义，说明在FC大鼠模型中，SS含量较正常明显升高，而针刺可在一定程度上降低FC大鼠血清SS含量[27]。SS是一种抑制性胃肠激素，升高的SS会抑制结肠蠕动，抑制胃动素、胃泌素等促胃肠运动激素的分泌，从而导致结肠传输功能变慢。由此推测，针刺治疗FC的机制可能与降低SS水平相关。

综上，针灸可以提高与胃肠运动相关的兴奋性递质的表达水平，降低与胃肠运动相关的抑制性递质的表达含量，起到双向调节的作用来治疗FC。

2 针刺对ICC的调控

2.1 ICC与功能性便秘的关系

Cajal间质细胞(Interstitial cells of Cajal,ICC)主要分布在胃肠道内部，是介于ENS和SMC之间的一类极其特殊的间质细胞。有研究证实[28]，ICC在胃肠道运动中起重要作用:①ICC是胃肠平滑肌自动节律性运动的起搏细胞，产生慢波电位并传导电活动；②ICC通过调节ENS传至SMC的信号，参与神经递质信号的传递；③ICC是一种非神经牵拉感受器可影响胃肠平滑肌的兴奋性和慢波的频率。目前,较多关于胃肠道ICC细胞膜上受体的研究，可知ICC表面可以表达多种受体蛋白，其中最重要的是c-Kit，它是ICC的特异性标记物之一，其表达异常可能引发ICC表型转化，并失去相应的功能[29-30]。现在国内外许多研究通过检测c-kit来了解ICC的在各种胃肠道疾病中的变化情况。研究发现,STC患者结肠内c-kit蛋白和c-kit mRNA表达水平降低，在STC患者ICC减少过程中c-kit信号通路扮演着重要角色，故ICC的分布及数量对肠道动力的发生和功能调控极其重要[31]。Taguchi等[32]报道显示，ICC减少及分布异常是STC患者肠道运动功能障碍产生的重要原因。朴莲花等[33]发现,单个ICC产生的起搏电流没有网络ICC稳定、频率快、幅度高，说明ICC是形成胃肠平滑肌节律性运动的起搏细胞，但是当它们形成网络才能完成起搏功能。

所以，ICC在FC胃肠道运动中起非常重要作用，是FC发病的可能重要机制之一，表现为胃肠道中ICC的分布、数量以及超微结构改变特别是ICC网络状结构破坏。

2.2 针刺调控ICC的表达

高纺等[34]针刺小鼠上巨虚穴可使STC小鼠首次排便时间缩短，12 h内排便粒数增加，STC小鼠ICC表达水平上调，说明针刺上巨虚可显著改善小鼠STC，STC小鼠ICC病理改变与结肠功能异常可能有关。针刺治疗STC可能通过上调结肠组织ICC表达水平来实现的。衣运玲等[35]研究发现，STC大鼠结肠c-kit、SFC蛋白表达下降，c-kitmRNA、SCF mRNA表达下降，而针刺可使以ICC减少为基础结肠的SCF/C-kit蛋白在表达生理范围内提高，表明ICC内C-kit信号可能是针刺治疗STC的重要通路。宁厚旭[36]在实验中对小鼠注射c-kit的中和抗体(ACK2)，发现小鼠结肠表现出ICC数目下降，成功摸拟了一种ICC的缺失状态，验证了在ICC生长发育过程中SCF/c-kit信号通路发挥重要作用，并推断出减少的ICC并没有死亡而是出现了表型的变化，而针刺后c-kit蛋白表达上升表明ICC功能出现恢复。盛红梅[37]研究发现,便秘小鼠结肠ICC的数目显著减少，且ICC突起连接杂乱或ICC彼此间不能形成完整的细胞网络，电镜下ICC内突起间的缝隙连接较小、溶酶体聚集、数量减少且脂质沉积。针刺治疗组ICC免疫染色阳性细胞个数明显多于模型组，针刺治疗组ICC形态、分布、细胞着色及网络结构的完整性均与正常组接近。针刺可影响ICC超微结构的改变，使得ICC与肠神经元及平滑肌细胞缝隙连接紧密，利于胃肠道神经信号的传递。

上述表明，ICC是ENS和SMC之间的桥梁，它的数量、形态、分布特别是网络结构对胃肠道动力的调控起着非常重要作用，针刺可以通过上调肠道ICC表达水平来治疗FC。

3 针刺对SMC的影响

3.1 SMC与功能性便秘的关系

平滑肌是胃肠运动单位的基本构件之一，也是胃肠运动的最关键因素之一。胃肠运动除依赖ENS的调节及ICC的参与外，还需有平滑肌的结构与舒缩功能完好。平滑肌由纵形肌和环形肌组成，肌层包括平滑肌细胞、成纤维细胞及Cajal间质细胞，其中平滑肌细胞(Smooth muscle cell，SMC)是维持胃肠运动的机械活动基础及生理基础，当出现排便反射时，SMC上表达多种信号递质受体，受外源性神经系统和胃肠神经系统的支配，使结肠平滑肌产生推进和收缩，将大便推至直肠，故便秘的形成与结肠平滑肌结构和功能异常有直接关系。Shafik A等[38]研究发现，结肠平滑肌收缩力在便秘患者中较排便正常者减弱，且其结肠运动减慢。Ding JH等[39]发现,在STC患者中大多存在结肠平滑肌肌病，如纤维化、肌细胞空泡样变等病理改变。

以上说明，SMC是胃肠电生理活动的执行者，它的结构和功能异常以及形成结肠平滑肌肌病，是FC发生的可能关键机制之一。

3.2 针刺对SMC的调控

张微[21]研究发现,针刺大肠俞募穴可减少SMC的凋亡，使SMC核内染色质分布均匀，胞浆中线粒体、粗面内质网及核糖体等细胞器数量增多，结构完整。表明针刺大肠俞募穴可通过抑制结肠SMC凋亡，改善其形态结构，进而增强结肠平滑肌收缩活动，促进肠道运动以治疗FC。孙建华等[40]研究发现,STC大鼠结肠功能障碍可能与结肠平滑肌结构和ICC病理改变有关。电针天枢穴可使大鼠结肠肠壁平滑肌结构与ICC趋于正常，可能是其治疗STC的机制之一。在消化道中NO是一种主要的抑制性神经递质，介导平滑肌舒张，减弱胃肠动力；VIP通过直接与胃肠平滑肌上的VIP受体结合，活化PKA，使平滑肌超极化，舒张平滑肌，减慢结肠运动。贾蕊等[41]研究电针、毫针、艾灸治疗FC，发现这3种刺灸方法通过抑制NO、VIP表达水平，兴奋胃肠平滑肌，加快胃肠道蠕动，促进排便。

根据上述可知，针刺相关腧穴治疗FC，可通过抑制SMC凋亡，改善其形态结构，进而增强平滑肌收缩活动，促进肠道运动来实现。

4 讨论

综上所述，ENS、ICC以及SMC三者相互连接，形成一个结构复杂、功能强大的独立的网络系统，构成胃肠运动基本功能单位。其中ENS在胃肠道运动中起主要调节作用，通过肠神经对ICC发出神经冲动信号，ICC作为胃肠起搏细胞，具有起搏和传播功能，同时作为信息整合的中转站，负责将信号传送至SMC，使平滑肌收缩或舒张来维持胃肠运动。总之，ENS-ICC-SMC网络体系的任何一个环节都至关重要，它们之间相互联系、相互作用，共同协调胃肠运动，假若某一环节出现缺失或功能异常均有可能引起FC或其他的胃肠道疾病。

针刺作为传统医学中比较古老的非药物治疗方法，简单、方便且无毒副作用，相对于药物治疗，针刺治疗FC疗效明显且优势显著，但其作用机制尚不十分明确。目前，针刺对于功能性便秘ENS-ICC-SMC网络体系的各个阶段研究成果均有相关报导，但还较为浅显,且高质量的研究文献数量尚不足，而ENS-ICC-SMC网络错综复杂，关于针刺治疗FC的机制可从以下两方面进行进一步的深入研究:①从ENS-ICC-SMC网络超微结构的整体入手，探讨针刺相关腧穴对ENS-ICC-SMC网络结构的调控，为针刺治疗FC提供实验依据;②表观遗传学机制对于哺乳动物正常生长和组织特异性的基因表达非常重要，表观遗传学修饰在疾病发生发展中的作用已不可忽视。研究FC的发生与肠道多种神经递质的基因表达失常联系密切，特别是胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)作为肠神经信号转导通路中的关键因子，它的甲基化修饰状态及其基因转录水平的变化，对维护肠神经系统的完整性，促进肠神经元的存活，调节胃肠动力发挥着重要作用。但目前关于FC表观遗传学的研究尚未发现，因此，可从GDNF基因启动子区的甲基化修饰状态及其基因转录水平入手，探讨针灸治疗FC的表观遗传调控机制，为针刺治疗FC提供实验依据。