卒中后免疫抑制与辅助性T细胞17变化的研究进展

徐瑞 马迪 包立阳 冯加纯

卒中后免疫抑制可以视为机体的自我保护，通过抑制外周的炎性反应，减少外周免疫细胞对中枢的入侵，阻止卒中后外周免疫细胞对梗死灶的二次损伤。多项研究证实，免疫系统不仅参与了缺血性或出血性脑损伤的发生与发展，在随后的疾病进展如再灌注损伤、血肿周围水肿形成过程中同样发挥着重要作用，卒中急性期坏死的神经细胞可释放损伤相关分子激活小胶质细胞，释放炎性因子、活性氧和一氧化氮等神经毒性物质，介导血-脑屏障破坏、黏附因子表达增多，吸引多种免疫细胞在卒中的不同时期浸润脑组织，进一步活化颅内胶质细胞分泌并且释放大量炎性因子，触发炎性级联反应，直接或间接损伤病灶以及病灶周围的神经细胞，加重脑损伤及神经功能缺损[1-2]。研究证明，卒中后单核-巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、T淋巴细胞和B淋巴细胞均浸润脑组织[3]。因此，卒中后患者外周免疫抑制可以减少外周免疫细胞浸润，抑制外周炎性反应和间接抑制中枢缺血性损伤的进一步恶化。

Yilmaz等[4]研究证实，CD4+T淋巴细胞在卒中后的炎性反应中起重要促进作用。前期研究结果证实，激活的小胶质细胞分泌白细胞介素(IL)23p40，可影响CD4+T淋巴细胞向辅助性T细胞17(T helper cells 17，Th17)分化，促进IL-17A的大量产生[5]。Th17能够破坏并且通过血-脑屏障，募集CD4+ T淋巴细胞并提高炎性因子的表达，进一步促进炎性反应[6]。同时Th17还可与颅内M1状态的小胶质细胞相互作用，促进炎性反应，加重神经细胞损伤[7]。IL-17A可招募中性粒细胞，还可协同肿瘤坏死因子α(TNF-α)促进颅内胶质细胞表达趋化因子，导致中性粒细胞浸润增多[8]。结合临床试验结果，我们推测Th17在卒中后炎性反应中占有重要地位，且进一步研究证实，炎性反应对缺血性卒中急性期脑损伤和缺血病灶的扩大起到推动作用[9]。

1 卒中后外周免疫状态的下调

临床试验结果表明，在卒中急性期，缺血后2 d外周血Th2水平相对于正常人群增高，而缺血后3 d Th2水平与正常人相同，而第8天又有上升趋势，提示外周血Th2水平在缺血后可能存在波动。相比于缺血早期，缺血后8 d外周血Th17水平明显升高，表明缺血8 d内外周血持续处于促炎状态。而整体CD4+T淋巴细胞水平开始下降，提示机体可能在短期的应激过程当中，中枢与外周的免疫细胞均被激活，但出于自我保护，机体通过自身调节，可能开始降低外周免疫状态[10]。

有研究报道，缺血性卒中急性期免疫状态的下调主要表现为外周淋巴细胞减少，单核细胞及淋巴细胞功能失调，免疫器官萎缩[11]。在临床研究中，Urra等[12]发现，卒中患者发病当天即出现Th细胞水平显著减少且凋亡增加(P<0.05)，同时Th细胞分泌TNF能力下降，提示Th细胞功能下降。Dolati等[13]发现，卒中后患者外周血中Th17在卒中后1、5 d升高，卒中后10 d下降且与对照组比较，差异无统计学意义(P>0.05)。在动物实验中，Joo等[14]对大脑中动脉闭塞(occlusions middle cerebral artery occlusions,MCAO)小鼠模型研究结果表明，缺血-再灌注后3 d，小鼠脾脏、外周血及淋巴结中CD4+T淋巴细胞明显减少(均P<0.01)。周有婷等[15]对MCAO大鼠研究结果表明，缺血后24 h，外周血中Th17显著升高(P<0.05)，3 d及7 d后逐渐降低，而Treg细胞的变化与之相反。

在外周免疫系统中，Th17主要通过分泌炎性因子募集、活化中性粒细胞，促进炎性反应，其中，IL-17A通过抑制信号传导与转录激活子家族1 (signal transducers and activators of transcription，STAT1)通路抑制Th1分化[16]。故Th17可能通过抑制Th1分化而影响Th1/Th2平衡，反馈性地抑制细胞免疫功能。Th2比例增高可抑制Th17的分化，导致卒中后Th17逐渐下降，由此调节卒中后免疫状态[17]。

2 卒中后免疫状态改变可能的相关机制

近年研究表明，以下几种机制可能为联系中枢神经系统与外周免疫系统的重要通路，在卒中免疫抑制中发挥重要作用：(1)卒中后脑内释放的炎性介质(如IL-1β等)可激活下丘脑-垂体-肾上腺(hypothalamus-pituitary- adrenal gland,HPA)轴、交感神经系统(sympathetic nervous system,SNS)、胆碱能抗炎通路(cholinergic anti-inflammatory pathway,CAIP)，同时，卒中是一种强烈的非特异性应激事件，也可激活以上通路影响机体免疫调节系统。(2)卒中后脑内炎性物质可通过破损的血-脑屏障进入外周，作用于外周免疫器官和免疫细胞，如高迁移率族蛋白1(high mobility group box 1,HMGB1)-晚期糖化终产物受体(receptor of advanced glycation end products,RAGE)通路。

2.1 HPA轴

卒中后，脑内释放的炎性物质作用于下丘脑室旁核激活HPA轴，导致促肾上腺皮质激素及皮质醇分泌,后者与靶细胞内激素受体结合，发挥抗炎及免疫抑制作用。一项纳入48项临床研究的系统综述发现，在大多数研究(27项研究，1 373例)中，卒中发生后的第1周内，皮质醇水平较高(超出参考范围)，表明HPA轴在卒中后被激活[18]。皮质醇可以影响免疫细胞的增殖、成熟、存活及运动；促进单核-巨噬细胞吞噬作用，抑制其免疫刺激作用，减少促炎介质(如细胞因子、趋化因子、活性氧)的产生；抑制抗原提呈细胞对T淋巴细胞的刺激作用；促进Treg细胞产生，抑制Th1及Th17分化[19-20]。

2.2 SNS

SNS主要受脑干的蓝斑核、中缝核及延髓头端腹外侧区的调控。此外，由于下丘脑室旁核与蓝斑、延髓头端腹外侧区等结构有纤维联系，HPA轴与SNS可以相互作用。Akil等[21]的研究结果表明，卒中后1 d和3 d，患者外周血中去甲肾上腺素水平明显升高，心率变异性分析中，平均正常窦性心搏间期标准差下降(P<0.01)，相邻正常窦性心搏间期差值超过50 ms的个数占总窦性心搏数的百分率增加(P=0.028)，提示SNS活动增强。去甲肾上腺素等儿茶酚胺类物质是SNS发挥免疫作用的主要物质，而β肾上腺素能受体(β-adrenergic receptor,βAR)广泛表达于大多数免疫细胞以及免疫器官表面，儿茶酚胺类物质与β2AR结合后可以发挥免疫抑制作用[22]。Prass等[11]研究结果表明，MCAO小鼠交感神经的激活可以抑制外周免疫反应，表现为单核细胞功能受损，淋巴细胞凋亡增加，使用β受体阻滞剂可以抑制淋巴细胞减少。同时，去甲肾上腺素与T淋巴细胞表面β2AR结合后可以抑制Th17的增值及功能[23]。

2.3 CAIP

Borovikova等[24]在体外实验中发现副交感神经的主要神经递质乙酰胆碱，可抑制巨噬细胞释放TNF-α、IL-1β等促炎因子，并提出由迷走神经介导的“CAIP”。以后这一通路逐渐完善，CAIP主要由迷走神经、脾脏及α7烟碱型乙酰胆碱受体(α7nAChR)组成。炎性介质可作用于迷走神经，传入至孤束核的信号可与迷走神经背核、疑核及最后区相互作用，其传出支通过腹腔神经节激活支配脾脏的交感神经，后者可促进脾脏中乙酰胆碱释放，乙酰胆碱进一步作用于免疫细胞上的α7nAChR，抑制核因子κB转录，最终导致单核细胞失活，TNF、IL-6等促炎因子降低[25]。

Lee等[26]研究结果表明，向脑出血小鼠注射毒蕈碱可以提高迷走神经兴奋性，减少脑内及脾脏中炎性介质，而脾脏缺失小鼠未能出现以上改变，由此证明脑内存在CAIP，其可以抑制脑出血后炎性反应，减轻脑损伤。Liu等[27]体外研究结果表明，90.0%～95.0%的CD4+T淋巴细胞可表达α7nAChR，使用烟碱刺激α7nAChR可抑制Th17分化(t=2.25，P<0.05)。以上研究结果表明，CAIP在出血及缺血性卒中模型中发挥免疫抑制作用，这一通路的激活可抑制Th17分化以及功能，减轻炎性反应，进一步探究卒中后CAIP对Th17的作用，可能为卒中后免疫调节提供新方向。

2.4 HMGB1-RAGE 通路

Liesz等[28]首次介绍了HMGB1通过作用于RAGE，作为急性脑损伤与免疫系统之间一种重要的联系，这一信号通路在脑损伤早期可以激活外周血单核细胞和树突状细胞，导致大量促炎细胞因子释放。随后，外周血免疫系统的过度激活导致单核细胞的耗竭，并且导致促炎因子分泌减少，而且这一信号通路独立于SNS。对短暂性MCAO大鼠的研究结果表明，HMGB1通过作用于树突状细胞或者直接作用于T淋巴细胞,导致外周血及脾脏中T淋巴细胞及CD4+T淋巴细胞减少，从而下调外周免疫[29]。

综上，卒中后机体通过神经-免疫机制及炎性介质的释放促进外周CD4+T淋巴细胞凋亡，下调外周免疫功能，其中HPA轴及CAIP的激活可调节各CD4+T淋巴细胞亚群的比例，直接抑制Th17的分化，导致Th17相关的炎性因子(如IL-17)减少，外周免疫状态下调，发挥脑保护作用。除以上提到的免疫调节机制外，免疫系统内细胞之间可相互制约、相互促进共同调节免疫状态。

3 卒中后免疫状态改变与Th17

多项研究结果表明，卒中后外周血中Th1/Th2比例发生变化，向Th2方向偏移，是机体细胞免疫减弱[1,14]。此外，Urra等[12]研究发现，卒中后患者外周血中Treg细胞减少并于发病第2天达低值(P<0.05)，其后逐渐升高，第7天与第2天比较升高明显(P<0.05)。Wang等[30]在短暂性MCAO小鼠模型中发现，卒中后交感神经激活可上调Treg细胞水平。而卒中后Treg细胞增加可抑制炎性反应，发挥脑保护作用[31]。故卒中后机体可促使CD4+T淋巴细胞向Th2及Treg细胞分化，减轻炎性反应和脑缺血-再灌注损伤。

3.1 Treg与Th17

研究表明，Treg细胞与Th17在分化上有互相排斥的信号通路。转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)和IL-2对Treg细胞分化至关重要，其中TGF-β可诱导Th0细胞(CD4+幼稚T细胞的一种)表达插头蛋白3(forkhead box P3，Foxp3)和维甲酸相关孤立受体γt，分别为Treg细胞和Th17的重要转录因子，此时细胞可向Th17或Treg细胞分化；而IL-2可磷酸化信号转导与转录因子5，促进Foxp3表达，对维持Treg细胞稳态十分重要，同时IL-2可抑制Th0细胞向Th17分化[32]。故当CD4+T淋巴细胞被激活后，在微环境(各种细胞因子，如IL-2、IL-12、IL-4、IL-6、TGF-β)的影响下，其可向不同T淋巴细胞亚群分化。如上所述，卒中后可上调Treg细胞水平，即Th0向Treg细胞分化倾斜，由此推测，机体向Th17的分化会减少，进而抑制卒中后Th17水平。

此外，Treg细胞可以分泌抗炎因子IL-10以抑制Th17分化。韩晶晶等[33]体外研究发现，在诱导CD4+幼稚T细胞分化为Th17的过程中，加入10 μg/ml IL-10中和抗体与无IL-10中和抗体组比较，Th17水平明显升高(22.1%±4.5%比8.1%±1.9%，P<0.05)。这可能与IL-10能够依次活化T淋巴细胞内的STAT5、细胞因子信号转导抑制因子3，抑制STAT3，进而阻断IL-6对Th17的激活作用有关[34]。此外，Treg细胞可以作用于淋巴细胞抗原4抑制抗原提呈细胞编码IL-6基因的表达，而后者是Th17分化的重要细胞因子，从而间接抑制Th17分化[21]。

3.2 Th1/Th2与Th17

IL-4可以诱导Th0向Th2分化，Th2主要分泌IL-4、IL-10等细胞因子以促进自身分化并发挥抗炎作用。Harrington等[35]向卵清蛋白肽刺激的野生型小鼠CD4+T淋巴细胞中加入IL-23和抗干扰素-γ抗体以促进Th17分化，之后分别加入IL-4或IL-4抗体以观察IL-4对Th17分化的影响，结果表明，IL-4可以显著抑制Th17分化(1.6% 比 8.4%)，表明Th2可通过分泌IL-4抑制Th17分化。因此卒中后Th2水平升高促使IL-4以及IL-10分泌增多，可能间接抑制Th17分化，减少Th17在卒中后的促炎作用。

4 小结与展望

Th17通过释放IL-17A以及其他炎性因子在卒中后炎性反应介导的二次脑损伤中发挥重要作用，其可能成为卒中后抑制炎性反应的治疗靶点。卒中在触发炎性反应的同时可下调外周免疫状态，其可能的调节通路为SNS、HPA轴、CAIP以及HMGB1-RAGE 通路。以上调节通路及其他T淋巴细胞亚群可作用于Th17，为卒中后调节Th17水平提供新依据。

目前关于Th17与卒中的转化研究较少。一项关于芬戈莫德应用于脑出血的临床研究表明，小至中量(5～30 ml)幕上深部自发性脑出血患者中，发病72 h内口服芬戈莫德可降低血肿周围水肿面积，减轻神经功能缺损，促进康复[36]。芬戈莫德是鞘氨醇1-磷酸盐受体调节剂，可作用于T淋巴细胞亚群，抑制Th17增值和分化，可能是其发挥作用机制之一。

综上所述，Th17对T淋巴细胞亚群有重要的调节作用，因此在未来的研究中可以Th17为靶点进行重点研究，以期为卒中后免疫治疗提供新的治疗途径。