循环肿瘤细胞在肝癌中的研究及应用进展*

郝以杰 牛哲禹 综述 卢俊 审校

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范围内第七大常见恶性肿瘤和第二大癌症相关死亡原因［1］，在我国每年约42万患者死于HCC［2］。随着诊疗水平的不断提高，目前针对HCC治疗的预后较以前已明显改善，但总体效果仍不理想。究其原因主要是与HCC早期诊断困难及易复发、转移有关。近年来由原发瘤灶释放入血的循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）引起的复发及转移成为研究热点。CTC检测与组织活检等传统检测方法相比，具有实时、高效、可重复性高等特点［3］，在HCC早期诊断、预后评估监测以及复发转移机制的研究中成为一种很有前景的检测形式及药物靶点。但由于HCC CTC在外周血中含量极低，并且种类各异，给富集与检测带来了困难，在一定程度上限制了临床对CTC的深入研究及应用。随着科学技术的不断革新以及研究的不断深入，CTC在HCC临床研究及应用中的重要价值已逐渐得到证实。现将有关HCC CTC的检测方法、临床研究及应用现状进行论述。

1 CTC概述

CTC是指自发或者因诊疗操作自肿瘤原发灶或者转移性病灶脱落进入外周血液循环系统的肿瘤细胞［4］，由Ashworth［5］于1869年首次提出。多项动物实验及临床研究表明CTC参与了肿瘤的术后复发及远处转移，并且能够较好的反映肿瘤在患者体内的动态变化。此外，不同肿瘤患者之间、同一患者不同肿瘤部位，甚至不同肿瘤细胞之间均存在明显的异质性［6］，为此，对CTC进行分子分型和功能分析，有助于对患者进行实时的生物学变化监测并制定精准的个体化治疗策略。随着各种检测技术的发明、发展及广泛应用，CTC的相关检测及研究已取得初步成果，并且展示出巨大的临床应用前景。

2 HCC CTC的检测方法

CTC发现后一百多年来，各种检测手段得到不断提高，为进一步研究CTC在HCC发生、发展过程中的具体作用机制提供了可能。目前的检测技术主要基于其大小、密度、细胞刚性及表面电荷等物理特性和细胞功能及细胞表面的肿瘤相关特异性抗原的生物学特性。随着新技术的不断涌现及临床应用，CTC检测方法也越来越丰富、高效，大致分为三代：第一代主要包括以梯度离心法、特殊滤过器以及免疫磁珠法为代表的批量处理CTC 的方法；第二代主要指流式细胞术、微流体芯片技术及CanPatrolTMCTC 检测技术等；第三代则是在第二代的基础上研发的能够对单个细胞进行分离的液滴微流体技术，该技术中通过微流体装置在单个细胞单元中形成液滴来分离细胞，含有单个细胞的液滴可用于研究每个细胞的特性、评估细胞的生存能力等，其仅在肺癌等研究中有相关应用报道［7］。目前在HCC CTC 研究中常用的检测方法有CellSearchTM系统、流式细胞术、微流体芯片以及CanPatrolTMCTC 检测技术等。各种检测技术的检测效率有所差异，各种检测方法的综合应用可能会提高检测效能。

Sun等［8］应用CellSearchTM系统从HCC患者外周血中检测出了HCC CTC，阳性率为68%；而Von Felden等［9］在HCC术后复发风险的研究中使用CellSearchTM系统检测CTC，检出率仅为15%，总体来说阳性率并不理想。分析原因可能是由于多数HCC细胞并不表达EpCAM，并且部分肿瘤细胞在HCC进展的过程中发生上皮间质化转变，失去包括EpCAM等细胞表型［10］。Ogle等［11］建立了联合细胞角蛋白、EpCAM、AFP、glypican-3、DNApk多种标志物免疫荧光成像及细胞大小、形态和DNA含量的流式细胞术检测HCC CTC的方法，在65%的HCC患者外周血中检测到CTC的存在，而在对照组内均未检测到CTC。Zhang等［12］将基于HCC细胞膜上表达的亚洲糖蛋白受体（ASGPR）与其配体特异性结合实验应用于微流体装置的CTC芯片，用来检测外周血中的CTC。结果显示所有HCC患者均检测到CTC，而健康、良性肝病及非HCC患者均未检测到CTC。该研究表明，微流体芯片技术用于检测HCC患者外周血中的CTC具有较高的敏感性及特异性。Ou等［6］使用CanPatrolTMCTC技术检测HCC患者外周血中的CTC，在165份血液样本中有117份（70.9%）检测到CTC≥2/5 mL。Chen等［13］报道的应用CanPatrol platform对195例HCC患者的外周血样本进行检测，检出率可达95%。可见随着科学技术发展及CTC的研究深入，HCC CTC的检测手段不断发展，目前已能够达到较高的敏感性及特异性，但多种检测手段均存在一定的弊端，还需要不断地探索理想的CTC检测手段。

3 HCC CTC的临床研究及临床应用

目前多种检测技术联合应用使得HCC CTC的检测获得了较好的敏感性和特异性，在临床分期、预后评价和疗效评估等方面已经逐步开展相应的研究并取得了一定成果。随着对CTC 的深入研究，越来越多的研究表明，不同形态及不同型别的CTC 在HCC的发生发展过程中发挥着不同的作用，因此仅从CTC在HCC患者外周血中存在与否以及含量的高低来进行预后评价以及确定复发的危险性等已远远不够。对CTC分类后再行进一步的精细化研究可使不同种类的CTC 在HCC 发生、发展中的作用特性更加清晰明了，并且为CTC的相关研究提供了新的方向。

3.1 CTC与HCC早期诊断

早期发现HCC 对改善患者预后至关重要，但目前的检测手段尚不理想。有研究表明，CTC与AFP联合检测可明显提高HCC 诊断的特异性及敏感性；传统HCC 诊断指标AFP 使用20 ng/mL 的截止值时，其灵敏度估计为53%，特异性为87%；而将AFP 阈值提高到100 ng/mL后，其特异性可达99%，但灵敏度仅为31%。而CTC 在HCC 诊断中具有很高的特异性，但灵敏度较低。Kalinich等［14］提出，在早期HCC筛查时，以AFP 20 ng/mL 为截断值灵敏度较高，外周血CTC检测特异性良好，两者联合可明显提高HCC 诊断的效能。Cheng 等［15］的研究结果也表明，CTC 计数是诊断HCC 有效的方法，联合使用CTC 计数和AFP 可明显提高HCC诊断的效力。尽管缺少大规模研究数据的支撑，但该诊断策略具有巨大的临床应用前景。

3.2 CTC与HCC临床病理特征

研究表明HCC患者外周血中CTC的阳性率与较差的临床病理特征（包括临床分期、血清AFP 水平、肿瘤数目及有无转移等）呈正相关。Chen 等［13］研究结果表明，HCC 患者外周血中CTC 计数与BCLC 分期、转移及血清AFP 水平密切相关；分期较晚、存在肝外转移及血清AFP＞20 ng/mL 的HCC 患者外周血中CTC阳性率明显增加。Ou等［6］的研究也得到了相似结果：在AFP水平较高、多发肿瘤、TNM和BCLC分期较晚、存在栓子或微栓子的患者中，CTC 增多更为常见。由此推测，CTC可联合传统病理特征共同反映肿瘤特性，但鉴于CTC检测手段的限制，目前尚未能在临床诊疗过程中广泛应用。

3.3 CTC与HCC预后

研究表明外周血CTC计数较高的HCC患者术后预后较差，复发风险较高，无病生存期（disease free survival，DFS）和总生存期（overall survival，OS）较低。此外，治疗后的外周血中的CTC 计数的变化能够反映治疗效果［16］，患者在治疗后（包括手术、介入、及靶向药物等）外周血中CTC 计数减少或消失提示治疗效果较好；而对于CTC 计数无变化及下降后又升高的患者往往提示治疗效果欠佳及肿瘤复发或产生耐药。Ye等［17］研究了CTC计数与乙肝相关肝细胞癌根治切除术后患者临床结局的关系，发现术后CTC计数较低（≤2/5 mL）的患者与计数较高（＞2/5 mL）的患者相比，DFS和OS均明显延长，表明更高的CTC计数可能是HCC不良预后的一个独立的标志。Yu等［18］研究了肝手术切除后HCC 患者CTC 的变化，结果表明术后CTC计数增加（术前CTC＜2，术后CTC≥2）的患者与CTC计数未增加（术前CTC＜2，术后CTC＜2）的患者相比DFS 和OS 明显缩短；术前和术后持续≥2 CTC的患者预后最差，而持续＜2 CTC的患者DFS和OS最长。以上研究结果表明术后CTC计数与HCC患者的预后明显相关。Hao等［19］为此进行了进一步的研究，结果显示前入路肝切除术后的患者与传统入路肝切除的患者相比外周血中的CTC计数明显减少，且2年复发率及2年生存率也明显降低，提示前入路肝切除与传统肝切除相比显著降低了术后CTC 的计数，并且明显改善了患者的预后。CTC在HCC预后的相关研究中已展现出了巨大优势，并且已使部分患者获益。相信随着更大样本的研究，其应用价值将得到进一步印证，并且能够使更大的人群从中获益。

3.4 不同表型CTC的特性

外周血中的CTC具有不同的表型，不同表型CTC的生物特性存在明显差异。研究表明与其它表型CTC 相比，间充质细胞型CTC 具有更高的转移潜能。Ou 等［6］利用上皮-间质转化标记物将从165 例HCC患者的外周血中富集到的CTC 分为上皮细胞型、间充质细胞型和混合表型三型，并分别分析了三种CTC表型与临床病理特征的关系。结果表明间充质细胞型CTC 多见于AFP 水平高、多发肿瘤、TNM 和BCLC分期较晚以及存在栓子或微栓子的HCC 患者。此外，肿瘤早期复发患者间充质细胞型CTC 阳性率较高并且生存分析显示间充质细胞型CTC 患者RFS 较短。因此认为，间充质细胞型CTC 往往发生在晚期患者，并与早期复发有关。该研究表明CTC 具有异质性，HCC 患者的CTC 表型可用于提示疾病进展和预测复发。Chen 等［13］指出，间充质CTC 可作为HCC患者肿瘤分期的生物标志物。随着CTC 研究的不断精细化，各种不同表型CTC 的特性已逐渐明了，CTC分型在临床研究中已取得初步成果并且具有巨大的潜在应用价值。

3.5 不同形态CTC的特性

HCC患者外周血中不同形态的CTC也具有不同的效能。CTC 在外周血中的存在形态可分为单细胞CTC 及细胞团CTM 等，CTM 一般由2～50 个细胞组成［20］，其中除了肿瘤细胞还包括血小板、成纤维细胞、内皮细胞以及白细胞等［21-23］。最近的研究表明，CTM 可能不仅仅是肿瘤细胞的聚集体，与单个CTC相比CTM在多数情况下具有更高的转移潜能和抗凋亡能力［24-27］。因此，对CTM的评估和计数可能为理解癌症生物学和癌症转移扩散提供一个新的维度，并且有可能为评价肿瘤预后提供新的生物标志物。

Aceto等［28］发现了在血液中存在与CTC结合的白细胞。Szczerba 等［29］对该类细胞进行了进一步的深入研究，从乳腺癌患者外周血中检测出CTC-WBC簇，将CTC-WBC簇内与中性粒细胞相对应的癌细胞分离出来后进行转录分析，发现与单独存在的CTC相比，CTC-WBC 簇内的CTC中促进细胞周期相关基因呈高表达，结果导致更高效的转移形成。因此认为，中性粒细胞和CTC 之间的联系促进了血液中肿瘤细胞周期的发展，并扩大了CTC 的转移潜能。此外，关于CTM 相比单个CTC 更具转移潜能的特性也已在胰腺癌、胃癌、结肠癌、头颈部癌及肺癌等相关研究中得到证实［24-27］，但缺乏HCC相关研究报道。值得注意的是，已有研究表明HCC 患者外周血中的中性粒细胞升高是HCC 患者预后的独立危险因素，并且中性粒细胞作为肿瘤进展和性能恶化的推动者具有独特作用［30］。然而其具体作用机制不明。综上，推测HCC患者外周血中的中性粒细胞也通过加快循环肿瘤细胞周期进展的方式促进了肿瘤的复发及转移。然而，目前尚缺乏相关临床研究结果。因此，为了更好地了解CTC及CTM在HCC复发及转移等方面的作用机制及临床意义，尚需大规模的临床试验及循证医学数据支撑。

4 结语

CTC的发现及深入研究在HCC诊疗方面发挥了巨大作用，使动态实时监测肿瘤进展及判断预后等成为可能，为HCC的诊疗提供了新的思路，并且已经成为HCC临床研究中的一种重要工具。目前尚有部分问题还未得到解决，如何在不影响其形态及生物学特性的基础上将一定量外周血中的全部CTC分离出来尚需进一步的研究。此外，已有研究表明仅从CTC的数目上反映HCC临床病理特征及预后远远不够，个体化的单细胞分析或许会成为以后研究的重点，但对分离出的CTC如何进行精细化研究（包括分型、分类以及单个细胞分析等）尚无统一标准。CTC的研究有可能为人类治愈HCC带来新的希望。