猪隐孢子虫、贾第虫及毕氏肠微孢子虫的研究进展

莫全 邓宇

（西昌学院动物科学学院 61500）

隐孢子虫病、贾第虫病及微孢子病作为3 种新兴传染病，分别由隐孢子虫 （Cryptosporidium spp.）、贾第虫 （G.duodenalis）及微孢子虫 （Microsporidium）3 种病原体引起，其爆发通常与饮用或食用被污染的水或者食物有关，因此被认为是水源性和食源性疾病[1-4]。隐孢子虫、贾第虫及微孢子虫均为寄生性原生生物，其宿主范围广泛，能感染家畜、野生动物和人类，其卵囊/包囊/孢子的传播主要通过粪-口途径，有直接传播（动物-动物接触、人-动物接触、人-人接触）和间接传播 （水源、食物源）两种方式。免疫功能健全的人感染隐孢子虫、贾第虫及微孢子虫后主要表现为自限性腹泻和暂时性的肠胃炎，通常能自愈；免疫功能不全者可出现致命性的顽固性腹泻[2-4]。人类感染隐孢子虫后通常伴随腹部疼痛、发烧、呕吐、吸收不良和严重的持久性腹泻。至今还未有针对隐孢子虫病的有效疫苗[5]。贾第虫又称蓝氏贾第虫或贾第鞭毛虫，动物和人感染贾第虫后可表现为腹泻、腹部绞痛、腹胀、体重减轻及吸收不良等症状。人感染贾第虫后通常无临床症状，尤其是发展中国家的人。目前发现的微孢子虫虫种至少有1300 种，归入了160个属中，Enterocytozoon、Encephalitozoon，Pleistophora、Trachipleistophora、Vittaforma、Brachiola、Nosema 和 Microsporidium 为主要感染人类的微孢子虫属。属于Enterocytozoon （肠上皮细属）的毕氏肠微孢子虫 （E.bieneusi）是造成人微孢子虫病的主要虫种。家猪 （Sus scrofa domesticus）和野猪 （Sus scrofa）均属于野猪种 （S.scrofa），其分布广泛，易于感染寄生虫从而造成经济损失，同时因其较易与人类及其他动物接触，在放养条件下容易接触污染水源，因此对猪隐孢子虫、贾第虫及毕氏肠微孢子虫感染情况进行调查非常必要，具有重要的公共卫生学意义。本文主要就猪隐孢子虫、贾第虫及毕氏肠微孢子虫的研究现状做一综述。

1 猪隐孢子虫、贾第虫、微孢子虫检测方法

1.1 猪隐孢子虫检测方法

隐孢子虫可以通过染色后镜检、检测荧光抗体或其他抗原检测方法等进行检测。改良的抗酸染色法 （Ziehl-Neelsen staining）是最常用的染色技术。镜检法需要的器材简单、成本较低，但敏感性和特异性低；荧光抗体检测技术敏感性更高，在一些研究中，其敏感性可达97%，而抗酸染色法敏感性为75%。但荧光抗体检测技术比抗酸染色成本高，需要荧光显微镜和专业人员进行操作。其他抗原检测方法如酶联免疫吸附测定、酶免疫检测和免疫层析 （试纸）检测，能减少检测时间，诊断敏感性在70%～100%[5]。PCR 技术具有特异性，能区分隐孢子虫虫种，已广泛应用于隐孢子虫临床诊断和环境监测等方面，SSU rRNA 基因是鉴定隐孢子虫常用的标记基因[5]。目前，在猪隐孢子流行病学研究中，研究者们多采用染色镜检与PCR技术相结合的方法，而单独采用镜检法或PCR 法的情况比较少。Kvác 等[6]、Langkjaer 等 [7]和 Chen 等 [8]就采用染色镜检与PCR 技术相结合的方法分别对捷克共和国、丹麦、中国的猪进行隐孢子虫流行病学检测和分子鉴定。Wang 等 [9]采取直接提取DNA 后用PCR 扩增标记基因的方法判定猪隐孢子虫感染情况。Nguyen 等 [10]采用改良的抗酸染色法对越南740 头猪进行隐孢子虫检测发现，134 头猪感染隐孢子虫，感染率为18.2%。Jeníková 等 [11]针对猪常感染的 C.suis 和 C.scrofarum 设计了种特异性引物 （Species-specific primers），用于试验后鉴定到的混合感染率达到10%，而常用的属特异性引物 （Genusspecific primers）鉴定到的混合感染率仅为0.2%，可见引物的改良提高了隐孢子虫虫种检测的灵敏度和准确性。

1.2 猪贾第虫虫检测方法

贾第虫可以通过PCR 扩增标记基因、染色镜检包囊、检测抗体、抗原等方法进行检测。分子生物学为检测贾第虫提供了强有力的方法，并且通过分析其属内遗传差异，对贾第虫分类学、群体遗传学及贾第虫病在人类和驯养动物的流行情况有了更深入的理解。最近的分子工具能在种/聚集体/基因型水平上鉴定贾第虫，已经广泛运用于贾第虫基因型的鉴定。分子诊断工具是由靶向基因位点 （如 SSU rRNA、gdh、tpi、ef1、bg 和vsp 基因位点）、基因位点数目及后续工作 （限制性片段长度多态性分析或PCR 产物序列分析）等组成的[4]。免疫荧光分析技术检测贾第虫包囊、免疫荧光抗体法检测包囊壁抗原和分子生物学的方法已经运用在猪贾第虫感染情况的研究中[12，13]。

1.3 猪微孢子虫检测方法

随着科学技术的发展，微孢子虫的检测技术越来越多，主要包括光学显微镜检查、血清学检查及分子生物学检查。光学显微镜检查方法需要结合特殊的染色法，但不能确定微孢子的虫种[3]。血清学方法检查微孢子虫主要是通过检测其IgG 和IgM，而宿主类型、机体的免疫状态、感染的微孢子虫虫种等因素又能影响检查结果。分子生物学方法具有特异性和敏感性等优点，已广泛用于微孢子虫虫种的鉴定。由于不同分离株之间内转录间隔区 （ITS）的rRNA 基因具有高度的多样性，因此，ITS 序列是目前最为认可的遗传标记基因，已经广泛应用于E.bieneusi 基因型的检测和鉴定的研究[3]。研究者也普遍采用PCR 扩增ITS 基因位点来检测猪感染毕氏肠微孢子虫的情况[14-16]。

2 猪隐孢子虫、贾第虫、毕氏肠微孢子虫的感染概况

2.1 猪隐孢子虫感染概况

目前，已发现了31 种有效的隐孢子虫种，超过20 种虫种或者基因型已经在人上被发现，分别是C.hominis、C.parvum、C.meleagridis、C.felis、C.canis、C.cuniculus、C.ubiquitum、C.viatorum、C.muris、C.suis、C.fayeri、C.andersoni、C.bovis、C.scrofarum、C.tyzzeri、C.erinacei、Cryptosporidium horse 和 Skunk and Chipmunk I genotypes，其中 C.parvum 和 C.hominis 是感染人类最常见的虫种，也是造成隐孢子虫病爆发的主要虫种[5]。C.suis 和C.scrofarum 又曾被称为猪基因型I 和猪基因型II，是感染猪主要的隐孢子虫虫种。研究表明，猪也能感染C.muris，C.tyzzeri，C.parvum，C.felis，C.hominis，C.andersoni 和 C.meleagridis 等虫种，而这些隐孢子虫均曾在人上被报道。研究表明，C.suis 和C.scrofarum 在猪中的分布与年龄相关，前者常见于断奶前仔猪，后者主要见于大猪。通过粪样检测、PCR 技术和血清学诊断的方法，在爱尔兰、加拿大、美国、澳大利亚、西班牙、捷克共和国等国家已有猪感染隐孢子虫的报道，且不同地区感染情况不同[17]。在中国，已经报道了重庆、陕西、上海、黑龙江、河南、江苏、台湾地区有家猪感染隐孢子虫，感染率为 3.3%～55.8%，感染虫种为 C.suis，C.scrofarum，C.andersoni和 C.tyzzeri[8，9，17-21]。目前关于野猪感染隐孢子虫的报道集中在欧洲国家，如西班牙 （7.6%～16.7%）、捷克共和国 （16.5%～16.9%）、波兰 （0%～8.5%）及斯洛伐克共和国 （5.4%），其感染率也各不相同。但仅发现3 种隐孢子虫可感染野猪，分别是C.scrofarum、C.suis 和 C.parvum，其中 C.scrofarum 为优势虫种，其次是 C.suis。C.scrofarum 是人畜共患虫种，已经在人类、家养动物、甚至是水中被检测到。因此，猪可能是隐孢子虫的储存宿主，然后将其传播给人类及其他动物[17，22，23]。

2.2 猪贾第虫感染情况

目前，贾第虫至少有8 个有效集聚体，集聚体A、B 为人畜共患型，具有广泛的宿主范围，集聚体C-H 具有宿主特异性，其中C/D 集聚体主要感染犬科动物，E 集聚体主要感染偶蹄类动物，F、G 和H 集聚体分别主要在猫科动物、啮齿类动物及灰海豹中被发现[4]。流行病学资料表明，澳大利亚、巴西、丹麦、加拿大、英国、挪威等国家猪存在贾第虫感染的情况，感染率为1.4%～66.4%，集聚体包括A-F。在发展中国家和发达国家，有研究报道了集聚体A、E 在家畜 （猪、牛羊等）、伴侣动物 （犬、猫、马等）、野生动物 （大猩猩、狼、海狸等中鉴定到A 集聚体；红疣猴、黇鹿等中鉴定到E 集聚体）中被检测到。关于野猪感染贾第虫的报道仅有一例。Beck等[13]运用荧光显微技术和PCR 法鉴定出野猪感染的为集聚体A 型。我们在近期试验发现，野猪感染了集聚体A 型和E 型，并且E 型为优势基因型，由于E 型也是感染家猪的优势基因型，贾第虫可能在家猪和野猪之间发生种间传播，但究竟是家猪还是野猪是传染源，这个目前尚不清楚。最近有研究报道了巴西里约的一贫民窟中有15 个人感染了E 集聚体，证明了人类也可以通过动物-人传播途径感染贾第虫E 集聚体[24]。综上所述控制猪源贾第虫病具有重要的公共卫生学意义。

2.3 猪微孢子虫感染概况

目前毕氏肠微孢子虫已经有超过200 多种基因型，根据系统进化分析将其分为8 个遗传组 （group1-8）：人畜共患的group 1 和具有宿主特异性的group 2-8。在中国，一些研究报道了家猪感染毕氏肠微孢子虫，并且鉴定出20 多种基因型，包括CS-1、CS-3、CS-4、CS-6、CS-9、CS-10、EbpA、EbpB、EbpC、EbpD、Henan-I、Henan-IV、G、D、H、O、LW1、CHN1、CHN7、CHN8、CHN9、CHN10、EBITS3、PigEBITS5、HLJ-I 至 HLJ-IV，大部分基因型都属于 group 1[14，25-28]。在国外，美国、日本、韩国、瑞士、泰国、捷克共和国等国家也报道了家猪感染毕氏肠微孢子虫的情况，鉴定出了D、CAF1、EbpC、O、PigEBITS7、EbpA、G、H、E1、F1、PigEBITS1 至PigEBITS8 等基因型[3]。目前在猪中鉴定到的基因型至少有60多种[29]。Slodkowicz-Kowalska 等 [30]通过变色酸 2R 和 FISH 法检测到波兰的一头野猪感染毕了氏肠微孢子虫，但未确定其基因型，这是野猪感染 E.bieneusi 的首次报道。Němejc 等 [16]对460 头野猪进行了毕氏肠微孢子虫分子流行病学调查发现，33头野猪粪便呈现阳性，鉴定出了 D、EbpA、EbpC、G、Henan-I、WildBoar1 至 WildBoar6 基因型，其中 EbpA 是最常见的基因型。本实验室对四川省部分野猪进行E.bieneusi 感染情况调查，结果发现了5 种新的基因型，（分别命名为WildBoar 7 至WildBoar 11）和 8 种已知的基因型 （EbpC、D、PigEBITS5、F、CHG19、CHC5、RWSH4 及 SC02），并且 EbpC 为优势基因型。

目前还未有很好的针对隐孢子虫病、贾第虫病及微孢子虫病的疫苗和药物，且隐孢子虫、贾第虫、微孢子虫作为重要的人兽共患机会致病性病原体，呈世界性分布，严重威胁人与动物的健康。家猪和野猪可能是动物和人隐孢子虫病、贾第虫病及微孢子虫病甚至是水源污染的重要的传染源。然而目前关于猪和野猪感染隐孢子虫、贾第虫、微孢子虫的研究资料还不充分，人们对传染来源及传播途径的理解还很有限，因此，研究者们还需要进行更多的关于动物、人、水源隐孢子虫、贾第虫、微孢子虫的分子流行病学调查，来更好的阐释其传播途径。