烟雾病易感因素研究进展

郭鹏宇 张豪杰 张增雨 李怡萌 范亚杰 齐金博 卢壮壮 邱艳艳 杨静怡 邢红霞 李超堃

烟雾病是一种以双侧颈内动脉末端及大脑前动脉、大脑中动脉起始部慢性进行性狭窄或闭塞为特征，并继发颅底异常血管网形成的脑血管疾病。东亚地区是烟雾病的高发地区，韩国、日本发病率较中国高，女性患病率高于男性，且家族性病例较散发病例临床表现更为严重[1]。烟雾病患者发病年龄呈双峰分布，儿童发病高峰在5岁左右，以脑缺血为主，成人发病高峰在40岁左右，以脑出血为主，欧洲发病情况则与之不同[2]。

烟雾病是血管生成异常性疾病，其发生、发展与血管管壁相关基因异常、血管生成内因子环境有着密不可分的关系。此外，血管病理显示管壁有淋巴浸润，提示炎性反应参与其中[3]。笔者从遗传、机体内环境、免疫3种因素对烟雾病的发生发展进行综述如下。

1 遗传因素

烟雾病患者存在种族易感性和家族聚集性，其发生、发展与遗传因素有密切关系。病理学研究显示，烟雾血管病变在血管内皮、血管平滑肌以及细胞外基质3个方面均有体现，其易感基因主要集中在内皮细胞表型相关基因环指蛋白213(ring finger protein 213，RNF213)、血管平滑肌细胞相关基因血管平滑肌细胞特异性肌动蛋白(vascular smooth muscle cell specific isoform of α-actin，ACTA2)、可溶性鸟苷酸环化酶α亚单位 (soluble guanylyl cyclase alpha subunit，GUCY1A3)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOSase)及细胞外基质代谢平衡相关的基质金属蛋白酶(MMPs)、金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases,TIMPs)基因家族。

1.1 RNF213

自2000年，人们发现烟雾病与神经纤维瘤病Ⅰ型关系以来，研究目光逐渐锁定了神经纤维瘤病Ⅰ型基因所在的17号染色体。2000年至2010年的研究主要围绕易感基因染色体定位问题展开。研究人员通过开展两点、多点、全基因组基因连锁分析以及微卫星标记分析，一步步将遗传区间缩小，最终确定烟雾病易感基因位于17q25。2010年至2013年，人们确认了RNF213基因为东亚地区烟雾病的首个易感基因，并对其变异情况以及可能的作用进行了初步探究。2013年之后，RNF213基因编码的蛋白质的功能性研究已成为一个亟待解决的问题，对RNF213与其他基因以及信号通路的相互作用可能成为烟雾病研究的突破点。

1.1.1烟雾病易感基因的染色体定位研究(2000年至2010年)：由于神经纤维瘤病Ⅰ型致病基因已证实位于17q11.2，2000年人们对24个日本家系烟雾病患者的17号染色体进行了微卫星标记基因连锁分析，结果发现，D17S939位点与烟雾病存在相关性(最大优势对数计分，maximum log10odds score,MLS=3.11)；多点连锁分析结果提示，致病基因在D17S785～D17S836之间9 cM的区域内(MLS=4.58)，初步证实了烟雾病相关基因位于17q25[4]。随后，研究人员检测到该9 cM区域内存在65个基因，并对其中的9个基因进行基因测序，但未发现与烟雾病有关的基因异常[5]。但这并不代表17q25无遗传意义，提示后续研究需要进一步缩小检测范围。2008年研究人员对15个家系患者进行全基因组基因连锁分析，同时对17q25-qter的12.5 Mb区间进行微卫星标记，结果均提示常染色体显性伴不完全外显烟雾病主要致病基因位于17q25.3[6]。后续研究进一步将候选易感基因区间缩小至D17S1806-17qter这一3.5 Mb的区间内[7]。研究团队对先前研究的15个烟雾病家系并2个新烟雾病家系进行了基因连锁分析和精确定位，对17q25.3区域内40个基因中的CARD14、Raptor和AAIK基因进行了测序，结果发现，位于Raptor基因转录区1480位点的ss161110142等位基因在亚洲烟雾病人群中的出现频率显著高于对照组，但未在高加索人群中检测到，进一步证实17q25为家族性烟雾病相关基因位点[8]。

1.1.2烟雾病易感基因RNF213基因的确定(2010年至2013年)：2010年，对东亚地区3个国家42个烟雾病家系进行的全基因组关联分析显示，烟雾病与17q25.3区基因多态性存在关联，利用对外显子组的分析，RNF213基因存在rsl12735431(p.R4810K)突变[8]。在东亚人群中进行的病例对照研究也显示，p.R4810K与烟雾病密切相关，rsl12735431位点基因突变者烟雾病发病风险为未突变者的111.8倍[9]。动物实验中，对斑马鱼RNF213基因进行敲除后，主干动脉管壁出现不规则病变及异常血管形成，提示了RNF213基因可能参与了颅内血管生成相关的信号通路调控过程[9]。随后，研究进一步发现p.R4810K变异与日本、韩国人群相关性强，而在中国人群中出现频率较低，在东南亚人群中未发现此变异[10]。日本、韩国人群基因变异呈单峰分布，而中国人群可能不是一种基因变异占主导。有学者对72例日本烟雾病患者进行了全基因连锁分析研究,对17q25-ter区间重点筛查，发现95%的家族性烟雾病患者及79%的散发烟雾病患者均存在RNF213基因p.R4859K(c.14576G>A)突变，进一步证明RNF213基因为东亚地区烟雾病的首个易感基因[11]。2012年，对中国烟雾病的研究显示，除R4810K变异，还检出P4007R、 Q4367L、A4399T等8个变异[12]，其中R4810K变异与临床缺血症状相关，而A4399T变异与临床出血症状相关。2017年，对日本烟雾病患儿的研究中发现p.Glu996Lys、p.His4058Pro等新的变异[13]。此外，中国烟雾病发病男 ∶ 女=1.3∶1,日本则为1∶1.8[12]，提示不同地区及种族，有着不同的流行病学表现和不同的RNF213基因变异谱[14]。

1.1.3RNF213功能与烟雾病发生发展(2013年始):RNF213基因长度为137 922 bp，由68个外显子组成，编码蛋白分子量为596 000 Da，研究发现干扰素β通过结合RNF213启动子区信号转导子和转录活化子1位点，启动RNF213的表达，RNF213环指蛋白具有AAA+腺苷三磷酸酶( adenosine triphosphatase，ATPase)和泛素连接酶活性[15-16]，其在组织细胞胞质中广泛存在，大小类似于核糖体，大部分以寡聚状态存在，在ATP、底物蛋白以及协同因子的作用下转化成聚合状态进而行使功能。聚合和寡聚状态分别由第1个和第2个AAA+ATPase操控，其中每个AAA+ATPase 各有一套A序列与B序列，分别结合ATP与Mg2+。泛素化连接酶活性区域，则参与细胞生理活动，如细胞周期、信号转导、DNA 修复和转录调节等。

RNF213基因在体内组织广泛表达，且在免疫组织中表达活性最高[11]。RNF213基因变异多集中在编码蛋白的环指区与羧基端之间，可能参与内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)对血管内皮的修复调节[14]。存在R4810K变异的内皮细胞，其细胞外基质相关基因表达下调，细胞骨架蛋白表达下调，基因转录剪接蛋白表达上调[17]。RNF213 p.R4810K变异会导致AAA+ATPase的蛋白结构长期陷入聚合状态，而聚合状态所发挥的生理功能会影响血管生成能力。研究人员通过基因本体论分析，发现RNF213的表达与感染、炎性反应相关基因表达有显著相关性，而磷脂酰肌醇-3激酶-蛋白激酶B与蛋白激酶R通路与RNF213表达上调有关[18]。该研究提示了炎性反应、感染等环境因素在烟雾病易感基因携带者中发病的重要作用，同时也表明了蛋白构象与疾病存在密切联系。

内皮细胞受损脱落后，若得不到循环池中的EPCs的有效修复，血管平滑肌细胞将启动增生修复，导致内膜增生。平滑肌细胞的迁移、增生、分化受内皮细胞调控，有丝分裂功能障碍将导致调控过程出现异常，进而导致血管生成异常。内皮细胞RNF213基因敲除后，通过调节细胞周期促因子的表达，进而降低细胞的增殖和血管生成[18]，而RNF213 p.R4810K变异会导致有丝分裂时间延长，抑制细胞增生[19]。另外，在内皮细胞中RNF213通过下调MMP的表达，影响细胞外基质的重构[18]。烟雾病起源自血管病变，有学者从血管新生的角度，提出烟雾血管征象与微囊蛋白-1(caveolin-1,CAV-1)的表达异常有关[20]。CAV-1参与物质囊泡转运、信号转导，是细胞信号分子整合平台，对于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)诱导的血管再生、EPCs趋化募集起至关重要的作用。研究表明RNF213的表达异常会使CAV-1表达水平下降，在RNF213变异的烟雾病患者，确实发现CAV-1表达降低[21]，并进一步指出烟雾病是一种CAV-1表达失常所导致的疾病，内皮功能损伤和细胞因子的表达失调并非其直接致病原因[20]。研究也发现CAV-1表达水平下降，会使血管内皮细胞增殖能力上升，同时内皮细胞的分化在血管管样改建中的作用下降[22]，进一步佐证烟雾血管病变与CAV-1的关系。

RNF213基因c.14576G>A突变纯合与否，可预测烟雾病的早发风险和症状严重程度。纯合突变发病早，病程急，病变可涉及到颅外血管，预后也较差，而杂合突变与疾病表型无明显相关性[23]。近年来发现RNF213 p.R4810K纯合变异在未患病人群中也可存在，并且在具有相同变异程度情况的孪生子之间，也可表现出不同的临床表型[24]。以上结果提示，烟雾病异质性不能简单归结于基因变异程度问题，环境因素也有很大作用[25]。动物实验显示，RNF213同源变异(RNF213,p.R4828K)在小鼠体内并不能充分诱导烟雾病的形成，多种继发环境因素参与烟雾病的发病过程[26]。小鼠实验中，RNF213基因敲除联合慢性缺氧诱导，可观察到血管新生能力提高，同时伴随有不正常的血管新生现象[27]，证实环境因素与遗传因素共同决定了烟雾病的发生。此外，短暂堵塞小鼠大脑中动脉6 h后，缺血大脑半球内的神经元会诱导表达RNF213[28]，对比体内和体外研究，血管新生与体内环境有很大关系，对于RNF213基因敲除小鼠，施加免疫佐剂后，发现调节性T细胞比例下降，说明RNF213与免疫稳态存在联系[29]。近年来研究发现，RNF213基因可能通过无翅型MMTV整合位点家族通路、干扰素β通路，或者通过参与调节非线粒体耗氧过程来发挥相关作用[30]。结合临床资料，我们推测，RNF213一方面通过基因过表达抑制有丝分裂关键蛋白垂体瘤转化基因-1的表达，影响血管新生；另一方面变异的RNF213基因通过在细胞周期和增生层面发挥作用，影响内皮细胞的信号转导，发挥致病作用。

1.2 平滑肌细胞功能相关基因

血管张力的改变会导致平滑肌细胞的增殖，进而引起烟雾血管样改变。平滑肌细胞张力的调节，一方面与编码肌动蛋白α2的ACTA2基因(位于10q23.3)有关，ACTA2基因突变会导致肌动蛋白α2的结构异常，影响其在细胞重塑过程中的作用；另一方面与一氧化氮-可溶性鸟苷酸环化酶-环磷鸟苷 (Nitric oxide-soluble guanylate cyclase-cyclic guanosinc monophosphate，NO-sGC-cGMP)信号通路有关，该通路中重要调节酶eNOSase和sGC变异，会引起信号转导异常，导致发病。

1.2.1ACTA2与烟雾病：生理情况下，由ACTA2基因编码的肌动蛋白α是构成细肌丝的主要成分，细肌丝与粗肌丝共同行使功能参与血管的舒缩，维持血管张力。ACAT2基因突变使肌动蛋白α含量下降，导致平滑肌细胞从分化成熟的收缩表型向去分化状态的合成表型转化，并伴随平滑肌细胞的迁移、增生，进而导致管腔狭窄[31]。

临床研究发现，ACTA2基因6号外显子R179H(杂合子)突变的患者，均表现双侧颈内动脉末端狭窄这一烟雾病影像学特征[32]。然而,在日本、欧洲及中国烟雾病患者中并未发现ACTA2基因的突变，有些学者因此提出ACTA2基因不是日本、欧洲及中国的一个易感基因[33]，这可能与样本量小、环境因素不同、烟雾病鉴别标准不一致有关。

1.2.2GUCY1A3、eNOSase与烟雾病：烟雾病患者病理性内膜增生和血流的剪切力改变有密切关系[34]。动脉分叉处血液由层流变为湍流，剪切力发生改变，而NO-sGC-cGMP信号通路能够改变剪切力对内皮细胞损伤的影响。该信号通路的改变可引起平滑肌细胞信号转导异常，颈内动脉分叉处血管重建的异常，其中eNOSase和sGC是该通路中的靶点环节。

eNOSase主要作用为调节血压，维持血管稳态，该酶的变异会导致NO合成异常，引起血管病变。sGC是由α、β两个亚基组成的异二聚体，有α1β1、α2β1、α1β2、α2β2 4种亚型，其中α1是由GUCY1A3基因(4q31.3-q33|4q31.1-q31.2)编码，有学者提出GUCY1A3错义突变和单倍不足会破坏NO信号通路，从而导致烟雾病的发生[35]。后续有研究结果表明，缺乏α1β1型sGC的平滑肌细胞对NO反应迟钝，从而使血管动力学改变的地方出现了异常血管的重建[36]。GUCY1A3(c.1550G>A，p.Cys517Tyr)突变导致sGC羧基末端的33个残基缺失，使得sGC催化区的折叠发生改变；小鼠动物实验结果也表明，sGC羧基末端残基与sGC的催化活性有关，其缺失会导致cGMP的含量降低、NO信号转导通路异常[35,37]。以上结果提示，NO通路的改变可能参与了烟雾病的发生发展。

1.3 细胞外基质相关基因

内皮细胞可合成分泌MMPs，同时也分泌TIMPs,而TIMPs在多个环节中抑制MMPs的活性，与MMPs共同维持细胞外基质降解的平衡。正常血管内皮中MMPs和TIMPs多以无活性的酶原形式存在。血管内皮受损后，MMPs和TIMPs被激活,参与细胞外基质胶原的重建过程,以便恢复血管组织结构和功能。研究发现，烟雾病患者体内MMPs与TIMPs的表达处于不平衡状态，表现为细胞外基质降解减少、合成增多，以及血管平滑肌细胞的增生，最终导致烟雾样血管的形成[38]。

1.3.1MMP基因:MMP家族蛋白能降解各种细胞外基质的蛋白成分,在血管生成方面发挥着重要作用。MMP-2基因(16q21)由13个外显子和12个内含子所组成，结构基因总长度为27 kb。2014年对韩国家族性烟雾病的研究中发现，MMP-2 -1575GA/1306CC基因多态性是烟雾病的易感因素，而这两者中单独一种基因型频率在正常人与烟雾病患者之间差异不大[39]，因此需要进一步去证实。

MMP-3基因(11q23)主要功能是降解细胞外基质和激活其他MMP。临床研究显示，烟雾病患者血清MMP-3表达水平显著降低，推测其低表达与发病相关[40]。2014年和2015年，两组不同的研究先后报道了中国汉族人群MMP-3基因多态性与烟雾病的关系，均发现MMP-3的1171位点多态性与烟雾病相关[41-42]。该变异在第 1171 位点启动子区插入或者删除变异体，分别称为5A、6A型变异。5A型变异使MMP-3启动子转录活性增强，使MMP-3高表达；6A型则降低MMP-3的表达。当发生6A型变异时， MMP-3表达水平降低，使其与TIMPs之间不能维持平衡，导致细胞外基质降解减少和细胞外基质重建，引起血管狭窄，导致烟雾病的发生[38]。

MMP-9基因(20q11.1-13.1)主要功能是降解和重塑细胞外基质的动态平衡。研究发现，烟雾病患者血清MMP-9水平显著升高，提示MMP-9表达上调可以使血-脑屏障结构改变，加重出血进程[38,40]。另一方面，由于血管生成需要血管基底膜的降解以及细胞外基质的重构，MMP-9的高表达有助于形成广泛的烟雾状血管。

1.3.2TIMPs基因：TIMPs家族是一个多基因家族的编码蛋白，是MMPs活性的特异性抑制剂，调节细胞外基质的代谢，参与细胞增殖等活动。研究显示，烟雾病患者血浆中TIMP-1和TIMP-2表达水平降低，推测TIMP-1与TIMP-2基因表达下调可能导致平滑肌细胞动员、迁移和增殖，促进血管狭窄[40]。在研究烟雾病患者血清MMP-9和TIMP-1表达变化时发现，患者血清TIMP-1水平和MMP-9/TIMP-1均高于对照者，且MMP-9与TIMP-1的表达变化呈正相关[43]，说明MMP-9与TIMP-1的表达处于失衡状态，这很可能是烟雾病的发病基础。

2 内环境因素

相对于健康人，烟雾病患者血清中碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)、VEGF表达水平及EPCs的数量均明显升高[44-45]。血管生长因子，如VEGF、bFGF、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)及其受体以及黏附分子、有丝分裂原等在血管形成中发挥着重要作用[45-46]。此外，RNF213 基因表达降低可使bFGF、TGF-1、MMP-9 等基因表达升高[42]。这些结果说明烟雾病的发生、发展离不开血管生成的内环境因素。

2.1 VEGF

VEGF蛋白家族及其受体可刺激血管内皮细胞增生，增加血管通透性，可能是血管新生过程的始发因素[8]。研究发现，VEGF可刺激平滑肌细胞移行,趋化募集血管EPCs，使病变血管内膜增厚，促进侧支循环和异常血管网的形成[8-9、46]。以上结果表明，血清高浓度的VEGF导致病变动脉内膜进行性增厚，引起血管狭窄闭塞，同时，VEGF有效促进烟雾病侧支循环和异常血管网的形成。

2.2 bFGF

bFGF参与内皮细胞的趋化移行、增殖，促进新血管的形成，对血管早期发育具有重要调节作用[47]。内源性bFGF可以通过刺激性或自分泌的方式控制细胞移行与侵袭作用，导致内膜增殖。烟雾病患者中，内皮细胞、平滑肌细胞、硬脑膜和血管壁内中bFGF含量增高，提示bFGF与烟雾血管内膜增厚有关[47-48]。

2.3 TGF-β1

TGF-β1是一种多功能的细胞因子。研究发现，将TGF-β1基因直接转染到正常动脉后，细胞外基质成分显著增多，并伴有与烟雾病相似的病理改变[21,44]。在烟雾病患者颞浅动脉平滑肌细胞中及血清中均检测到TGF-β1的表达水平显著升高[49]，推测TGF-β1可能参与烟雾病患者血管内膜增生及新生血管形成过程。

2.4 HGF

HGF在组织再生中起着重要的作用，具有较强的促进血管生成和血管修复的功能。研究发现，烟雾病的HGF水平较颈内动脉闭塞患者显著性升高[50]，HGF可能通过刺激侧支循环和异常血管网的形成，同时，可刺激病变动脉中膜平滑肌细胞迁移、增殖,进而促使管腔进一步狭窄或闭塞。

2.5 血小板衍生因子 (platelet derived growth factor,PDGF)

PDGF可以促进血管内膜增生，调节血管平滑肌细胞的增殖。研究发现，烟雾病患者血浆PDGF-BB水平明显高于健康对照组[48,50]，推测PDGF可能通过刺激平滑肌细胞的移行、增殖以及细胞外基质大量沉积而发挥作用，进而导致烟雾病动脉的狭窄。

2.6 EPCs

EPCs是血管内皮细胞的前体细胞,来源于单核-巨噬细胞系。缺氧或血管损伤后，EPC可募集到全身血液循环中，并分泌多种促血管生成、生长因子，在血管的再生、修复、重建等过程中发挥重要作用[51]。研究发现，烟雾病患者VEGF和表达水平均显著上升，并且由VEGF和集落刺激因子介导的EPC的动员不完全，烟雾病患者强大的血管生成能力可能与之有关[44,51]。因此，循环中EPC数量和功能的改变可作为烟雾病的诊断或预后指标。

3 免疫及炎性反应与烟雾病

有研究表明，免疫因素参与烟雾病的发生、发展[52]。烟雾病很可能是患者具有特殊易感基因，在一些外来致病因素作用下，出现的机体免疫机制异常所致。

3.1 人类白细胞抗原基因复合物

对烟雾病患者和健康人进行人类白细胞抗原基因的DNA分型，结果显示患者DRBI*0502基因频率显著增加，而DRBI*0405、 DQBI*0401基因频率显著降低。作者就此提出人类白细胞抗原等位基因与该病的关系：一是这些等位基因是烟雾病的易感基因；二是烟雾病易感基因与人类白细胞抗原等位基因存在连锁不平衡[53]。

3.2 免疫相关基因

对烟雾病患者的外周血液淋巴细胞进行自身免疫和炎性反应的分类基因芯片进行研究分析，发现有32个基因发生异常表达(19个基因表达增加，13个基因表达降低)，其中与细胞免疫相关的基因有23个，与体液免疫相关的基因有9个[54]。这些基因可能参与到免疫系统的调节中，从而引起烟雾病的发生。

3.3 免疫复合物

报道显示，烟雾病主干血管及内弹力膜下IgG、IgM 免疫组化染色阳性[55]，提示免疫复合物可能参与烟雾病的发病过程。

4 讨论

烟雾病是一种不遵循传统孟德尔遗传模式的疾病，单个基因并不能充分解释其遗传易感性，烟雾病可能是受到多个基因位点的影响产生复杂的交互作用导致的。除此之外，感染、炎性反应等环境因素在烟雾病发病过程中也发挥着重要作用。结合文献资料，我们提出以RNF213基因为核心的发病机制猜想，即感染、免疫、缺氧等诱导干扰素β免疫因子的表达，可使RNF213表达活性增强。未突变的RNF213基因的过表达可解除机体对内皮细胞增殖的抑制作用；此外，突变的RNF213会影响细胞膜上CAV-1的分布，导致血管促新生因子如VEGF、HGF、bFGF等介导的细胞内信号转导的异常，最终使得血管生成障碍。MMPs作为RNF213基因的作用靶点，其表达的正常与否，关系到细胞外基质的代谢平衡，该基因的表达异常也与烟雾血管的形成有关。

5 展望

烟雾病的病因至今尚未阐明，这给该病的早期防治及易感人群的筛查带来了困难。对于其病因及发病机制的探索，多集中于各种易感因素的交互研究，由于各研究均存在样本量少这一不足之处，所以很难得出准确的结论。大样本量的研究或许更能揭示烟雾病的发病机制，从而探求利用基因检测和早期诊断的方法，为靶向治疗提供基础。

目前手术重建仍存在脑血流高灌注等并发症，鉴于此，非手术疗法的积极探索，可以从以下几个方面考虑：(1)血管新生刺激因子研发；(2)联合抗癌药物，抑制平滑肌细胞增生；(3)应用视黄酸抑制平滑肌细胞的迁移；(4)提高CAV-1的含量；(5)干细胞疗法的介入。随着对致病机制的研究的深入，将来我们有望在基因层面针对特定的致病基因进行靶向治疗，或在细胞因子层面为烟雾病的前期诊断提供多层次的证据。