基于网络药理学方法分析羚羊角散治疗子痫的作用机制*

姜 洋 刘松君 李 超

1 浙江省立同德医院 浙江 杭州 310012

2 浙江大学医学院附属邵逸夫医院 浙江 杭州 310016

子痫是妊娠期高血压的严重阶段，可能导致胎儿生长发育迟缓、早产、缺氧，甚至死亡，也可能导致孕妇胎盘早剥及弥漫性血管内凝血[1］。及早发现并积极处理轻度子痫前期可改善患者症状，阻止病情进展至重度子痫前期和子痫阶段，改善妊娠结局。中医药治疗先兆子痫具有特定优势[2-3］。羚羊角散（羚羊角、独活、防风、当归、川芎、茯神、酸枣仁、薏苡仁、木香、甘草、杏仁）出自《济生方》，具有平肝息风、养血安神之功效，主治妊娠子痫。临床常用于治疗妊娠高血压综合征等属于肝旺生风证者。

羚羊角散作为经典名方在临床上具有确切的疗效，但其确切的作用机理尚不清楚。前期研究发现S100P蛋白促进滋养细胞的增生及侵袭迁移能力，提示S100P可能在妊娠子痫的发生中具有一定作用。本研究将通过对多数据源整合，通过网络药理学方法挖掘羚羊角散具体的作用靶点及可能的药物作用机理。

1 材料与方法

1.1 多源信息融合获取子痫相关基因：信息源1来自NCBI基因数据库：以eclampsia检索NCBI基因数据库，检索得到334个与子痫相关的基因；信息源2来自临床治疗子痫药物：用于治疗子痫的首选药物是硫酸镁，硫酸镁共作用于6个靶基因；共计340个基因。

1.2 采用DAVID工具对子痫相关通路进行分析：KEGG

数据库是一个联系基因组信息和功能信息的知识库，其子数据库PATHWAY汇集了分子交互作用及其反应网络人工通路图[4］。DAVID是一个在线功能注释系统，包括：基因功能注释、通路注释等。网址为http：//david.abcc.ncifcrf.gov/。利用该工具分析通路可以直观观测到查询基因所富集的通路信息、富集通路所含的基因及相应的蛋白信息，若分析和某一疾病相关的重要通路，则可根据阈值(P＜0.05)确定重要的通路来进行重点分析，有助于了解疾病的分子基础，并为新药研发提供可借鉴的思路。

1.3 羚羊角散治疗子痫疾病“药物分子-疾病-靶点”网络构建：基于关联规则，采用软件BATMAN-TCM[5］在线分析工具预测羚羊角散的作用靶点，通过挖掘组分间关系，构建药物-靶点-疾病网络，深化对子痫疾病与组分配伍的规律认识。

2 结果

2.1 子痫相关基因通路富集分析：340个子痫相关基因共有230个基因富集到85条通路中。富集程度排名前十的通路分别为Pathways in cancer、Cytokine-cytokine receptor interaction、PI3K-Akt signaling pathway、Herpes simplex infection、HIF-1 signaling pathway、Rheumatoid arthritis、MicroRNAs in cancer、Chagasdisease(Americantrypanosomiasis)、Tuberculosis、Proteoglycans in cancer。

基因在各通路中出现频率越高，表明其参与该疾病的可能性越强。在以上显著富集的10条通路中出现频次达7次的有基因ID：3569（gene name：IL-6）、出现频次6次的有356（FasL）、出现频次5次的有1387（CREBBP）、1956（EGFR）、2033（EP300）、3458（IFNG）、3459（IFNGR1）、3460（IFNGR2）、355（FAS）、7040（TGFB1）、7097（TLR2）、7099（TLR4）、7124（TNF）、7422（VEGFA）。上述在显著富集通路中高频出现的靶基因可能和子痫的发生存在紧密的联系。

2.2 羚羊角散复方中小分子化合物作用靶点分析及网络构建：羚羊角散由11味中药共包含766个单体化合物，其中233个化合物在BATMAN-TCM数据库无结构信息，靶蛋白无法预测。其余533个化合物中有18个化合物作用靶点为S100家族。可见S100蛋白家族为羚羊角散复方的重要靶点群。同时羚羊角散复方388个靶基因显著富集在46个通路中，在46个通路中出现频率达10次以上的基因有9个，包括ITPR1、ITPR3、ITPR2、CACNA1C、CACNA1D、CALM1、CALM2、CALM3、CACNA1S。在上述9个基因上开发的药物多数为钙通道阻滞药物及神经系统药物，如氯维地平、咖啡碱。表明羚羊角散具有和西药氯维地平、咖啡碱类似的效果，能降压和镇静。

羚羊角散治疗子痫疾病“药物-疾病-靶点”网络构建包含全部533个化合物、作用的靶蛋白、疾病和信号通路。药靶网络显示，最少有20种化合物作用于该靶点。OMIM疾病数据库显示主要和疼痛相关。

2.3 治疗妊娠子痫首选药物硫酸镁药物靶点分析：目前，用于治疗子痫的首选药物是硫酸镁（Drugbank数据库ID：DB00653）。其共作用于6个靶蛋白，分别为CCG1_HUMAN（gene ID：786）、CA2D1_HUMAN（781）、CAC1C_HUMAN（775）、CACB1_HUMAN（782）、CACB2_HUMAN（783）、CAC1S_HUMAN（779）。在该6个靶蛋白上共开发了26种药物，26种药物为钙离子通道阻滞剂或利尿剂，其用途主要为降血压及预防心绞痛。该26种药物共作用于163个基因。其中VCAM1_HUMAN（7412）、S29A2_HUMAN（3177）、S29A1_HUMAN（2030）、S100B_HUMAN（6285）、C11B2_HUMAN（1585）、ADA1D_HUMAN（146）6个基因包含在子痫340个相关基因中。说明硫酸镁治疗子痫不仅是单作用于已知的6个基因，上述的6个靶基因也可能为硫酸镁的潜在作用靶点。经KEGG通路数据库分析发现，163个基因主要富集在Neuroactive ligand-receptor interaction、Nicotine addiction、Calcium signaling pathway、HIF-1 signaling pathway、Retrograde endocannabinoid signaling、Morphine addiction、Serotonergic synapse、cAMP signaling pathway、MAPK signaling pathway等信号通路中。其中钙离子信号通路和MAPK信号通路也同时为羚羊角散靶基因显著富集的通路，表明这两个通路可能为子痫发生发展重要的靶通路[6-7］。

2.4 作用于S100P蛋白的药物及靶点分析：目前Drug-Bank数据库中作用于S100P蛋白的药物只有Cromoglicic acid(色甘酸)一种，其作用靶点为KCMA1_HUMAN（KCNMA1）和S100P_HUMAN（S100P）。同种药物作用于不同靶蛋白，说明该多个靶蛋白靶点结构相似。所以，以下作用于KCNMA1的药物，也可能作用于S100P。作用于KCNMA1的药物共9种，属于利尿降压药、麻醉镇痛药、抗过敏药和抗真菌药。上述药物中有7种其对应的适应症与硫酸镁具有较高相似性，我们推测S100P可能为子痫用药的重要潜在靶点。检索基因数据库发现同S100P存在相互作用的基因共有21个，包括TERF2IP、AGER、IL-11、S100B、TFIP11、S100A1、S100A2、S100A4、S100Z、PSMD4、PPM1G、NUSAP1、LRRC45、KRAS、CDH1、CCDC103、EZR、SUGT1、BAG3、ESR2、IGBP1。S100P除了同S100家族的其它5个基因存在互作外，还同白介素受体IL-11以及AGER存在相互作用。而在子痫相关基因显著富集的通路中，白介素相关受体IL-6出现频率为最高。有研究表明孕晚期IL-6升高和维生素D缺乏导致子痫前期发生风险[8］。

上述研究说明S100蛋白家族成员和子痫发生存在较强关联，无论中药羚羊角散还是西药硫酸镁，S100蛋白家族成员均为其重要靶点群。钙离子信号通路和MAPK信号通路可能为子痫发生发展的重要靶通路。我们猜测，S100P可能通过（相互作用）调控白介素或S100蛋白家族相关受体，促使其表达水平升高进而导致子痫。

3 讨论

中药复方的临床疗效是其多个活性成分交互作用的综合体现，而不是单一化学成分的单独作用。因此，本研究对已上市一线药物靶点进行解析，同时结合网络药理学筛选羚羊角散核心靶点及靶通路。基于二者共同的药物靶点及潜在信号通路，分析得出白介素受体、S100蛋白家族靶蛋白为核心靶点，化合物其作用的潜在信号通路为钙离子信号通路、MAPK信号通路和子痫发生密切相关，也是决定羚羊角散临床疗效的关键。本研究结果为中医药治疗子痫的药物作用机制研究提供新的思路。