PEDF对氧诱导视网膜病变小鼠视网膜MCP-1表达的影响

王亚娜，张 磊

0引言

视网膜新生血管(retinal neovascularization，RNV)的形成是缺血缺氧性视网膜病变中最重要的病理过程，病变进一步发展可导致视功能不可逆性损害甚至丧失[1]。越来越多的研究表明，色素上皮衍生因子(pigment epithelium-derived factor，PEDF)兼具抑制新生血管形成和神经保护的作用[2]。单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)是趋化因子家族中的主要成员之一，在肿瘤、炎症、视网膜色素变性和糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy，DR)等缺血缺氧性疾病中起着重要的作用。本研究通过建立氧诱导视网膜病变(oxygen-induced retinopathy，OIR)小鼠模型，观察PEDF对视网膜新生血管和MCP-1表达的影响，旨在进一步探讨PEDF对缺血缺氧性视网膜病变的保护作用和机制，为PEDF治疗缺血缺氧性视网膜病变提供理论依据。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1实验动物C57BL/6J新生小鼠160只，7日龄，雌雄不限，清洁级，由上海市瑞金医院动物房提供，动物饲养条件符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》。

1.1.2主要试剂和仪器重组PEDF蛋白(美国Peprotech公司)；荧光标记的GS-Isolectin B4(Vector Laboratories)；RIPA裂解液(美国Sigma公司)；BCA试剂盒(美国Thermo Scientific公司)；5%脱脂奶粉；SYBR green PCR试剂盒(日本Takara公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)；PEDF兔抗单克隆抗体一抗(sc-25594，美国Santa Cruz公司)，MCP-1兔抗单克隆抗体一抗(ab25124，美国Abcam公司)，甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)兔抗单克隆抗体一抗(ab9485，美国Abcam公司)，辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔二抗(碧云天生物技术公司，A0208)；PVDF膜(美国Millipore公司)；Quantity One图像处理系统、蛋白电泳系统(美国Bio-Rad公司)；荧光定量PCR仪(美国ABI公司)。

1.2方法

1.2.1小鼠OIR模型的建立采用随机数字表法将160只7日龄小鼠分为正常组(24只)、正常对照组(16只)、OIR模型组(40只)、PBS治疗对照组(40只)、PEDF药物治疗组(40只)。参照既往方法[3]制作OIR模型。取7日龄C57BL/6J新生小鼠与哺乳母鼠共同置于氧浓度为(75±2)%的氧环境内饲养5d，然后返回正常氧环境中饲养5d，建立OIR模型；正常组及正常对照组小鼠始终置于正常氧环境饲养。

1.2.2小鼠玻璃体腔注射所有小鼠均取右眼为实验眼。参照既往PEDF玻璃体腔注射的方法[4]，12、14日龄时PEDF药物治疗组和PBS治疗对照组小鼠玻璃体分别注射等量的PEDF(1μL，2μg/μL)和PBS(1μL，10mmol/L，pH=7.4)；正常组小鼠不作任何干预，正常对照组小鼠分别于12、14日龄时玻璃体腔注射等量PBS(1μL，10mmol/L，pH=7.4)，注射后氧氟沙星眼膏涂眼预防感染。

1.2.3小鼠视网膜铺片和染色造模结束17日龄时，所有小鼠过量麻醉处死。各组随机抽取8只小鼠摘除右眼球，立即浸泡于40g/L多聚甲醛溶液中固定2h，手术显微镜下用角膜剪沿眼球的角巩膜剪开，去除角膜、虹膜、晶状体和玻璃体，分离出完整视网膜组织，用PBS(10mmol/L，pH=7.4)漂洗后以1∶50稀释的GS-Isolectin B4染色液对游离视网膜进行染色，室温避光45min～1h；用PBS漂洗后在手术显微镜下以视盘为中心做5～6个放射状切口，平铺于载玻片上，树脂胶封片。全部视网膜分为5～6瓣，荧光显微镜下照相，观察是否出现血管迂曲扩张、微血管瘤和新生血管的形态。Image Pro Plus 6.0计算各组RNV面积进行统计。

1.2.4Western-blot检测视网膜组织中PEDF和MCP-1蛋白的表达造模结束后(P17)，所有小鼠过量麻醉处死。手术显微镜下分离取出所有小鼠视网膜，液氮迅速冷冻后转移至-80℃冰箱保存。取出冰箱中保存的各组视网膜放入匀浆杯中，4℃条件下12000g离心10min后，加入预冷的蛋白裂解液200μL，冰上作用30min，振荡混匀，4℃条件下14000g离心15min后取上清液提取蛋白，后酶标仪测蛋白浓度，计算含40μg蛋白的溶液体积为上样量，与蛋白上样缓冲液混合后100℃加热5min使其变性，常规聚丙烯酰胺凝胶电泳，半干法将蛋白转移至硝酸纤维薄膜上，5%脱脂奶粉室温封闭1～2h，三羟基甲基氨基甲烷缓冲液(TBST)洗膜后分别加入按1∶100稀释的PEDF、MCP-1一抗以及1∶1000稀释的GAPDH一抗；4℃摇床过夜后洗膜，分别加入1∶500稀释的辣根过氧化物酶(HRP)标记的相应二抗。室温下孵育2h，TBST洗膜10min×3次。进行ECL化学发光显色并拍照，以GAPDH作为内参照。用GIS-2020凝胶图像分析系统扫描蛋白条带的光密度(OD)值，以目的蛋白与内参蛋白GAPDH OD值的比值作为目的蛋白的相对表达量，并依此进行统计分析。

图1全视网膜铺片染色观察各组视网膜新生血管形态的变化(×400) A：正常组；B：OIR模型组；C：PBS治疗对照组；D：PEDF药物治疗组。

1.2.5RT-PCR检测视网膜组织中PEDF和MCP-1mRNA的表达取出冰箱中保存的各组视网膜，每组随机取8个视网膜样本，Trizol试剂一步法提取总RNA，分光光度计测定A260、A280及其浓度，根据A260/A280和A280/A260的比值鉴定总RNA纯度，后逆转录合成cDNA第一链。各引物序列利用Gene Runner软件设计并经NCBI BLAST检索无显著同源性序列，引物设计合成：PEDF上游引物：5’-TCTGGGAGCTGAACATCGA-3’，下游引物：5’-GGGCAGTAACAGAGGCAAG-3’；MCP-1上游引物：5’-ACTGAAGCCAGCTCTCTCTTCCTC-3’，下游引物：5’-TTCCTTCTTGGGGTCAGCACAGAC-3’；β-actin上游引物：5’-CTTCTTTGCAGCTCCTTCGT-3’，下游引物：5’-GTGCCAGATCTTCTCCATGT-3’。采用SYBR green PCR试剂盒优化反应条件，使目的基因和管家基因的扩增效率保持一致，接近于1。ABI Prism 7500-HT定量PCR仪扩增，反应完成后，软件进行自动数据分析，2-△△Ct表示目的基因相对表达量。每组8个样品，实验重复3次。

2结果

2.1PEDF对氧诱导小鼠视网膜新生血管的影响各组小鼠视网膜血管染色铺片显示，造模结束时(P17)，正常组小鼠视网膜血管呈放射状自视盘发出，走形平滑自然，分支良好(图1A)；OIR模型组和PBS治疗对照组小鼠视网膜中央均出现程度不同的无血管化区及迂曲扩张的放射状新生血管丛，新生血管成簇或成团分布(图1B、C)；PEDF药物治疗组小鼠视网膜新生血管团较PBS治疗对照组明显减少(图1D)。统计分析显示：正常组、OIR模型组、PBS治疗对照组、PEDF药物治疗组病理性新生血管面积分别为1.055±0.163、8.538±0.975、6.860±1.397、2.306±0.984mm2，组间差异有统计学意义(F=93.386，P<0.001)。OIR模型组、PBS治疗对照组小鼠视网膜新生血管面积较正常对照组都增高，差异有统计学意义(均P<0.01)；PEDF药物治疗组小鼠视网膜新生血管面积较PBS治疗对照组显著减少，差异有统计学意义(P<0.01)；正常组小鼠视网膜新生血管面积与PEDF药物治疗组比较，差异无统计学意义(P=0.121，图2)。

图2各组小鼠视网膜新生血管面积的比较bP<0.01vs正常组；dP<0.01vsPBS治疗对照组。

图3Westernblot检测正常组和OIR模型组视网膜PEDF和MCP-1蛋白表达量A：PEDF；B：MCP-1。

2.2氧诱导视网膜病变中MCP-1、PEDF蛋白和mRNA的表达Western-blot检测结果显示，与正常组小鼠视网膜PEDF蛋白的相对表达量相比，OIR模型组小鼠视网膜PEDF 蛋白相对表达减少，差异有统计学意义(0.82±0.44vs0.55±0.23，t=5.67，P<0.01，图3A)。与正常组小鼠视网膜MCP-1蛋白的相对表达量相比，OIR模型组小鼠视网膜MCP-1蛋白相对表达增加，差异有统计学意义(0.45±0.06vs0.88±0.10，t=5.61，P=0.04，图3B)。

RT-PCR检测结果显示，与正常组小鼠视网膜PEDF mRNA的相对表达量比较，OIR模型组小鼠视网膜PEDF mRNA相对表达减少，差异有统计学意义(0.27±0.03vs1，t=3.35，P<0.01，图4A)。与正常组小鼠视网膜MCP-1 mRNA的相对表达量比较，OIR模型组小鼠视网膜MCP-1 mRNA相对表达增加，差异有统计学意义(3.63±1.05vs1，t=4.43，P=0.046，图4B)。

2.3PEDF对氧诱导视网膜病变中MCP-1蛋白和mRNA表达的影响Western-blot检测结果显示，各组间差异有统计学意义(F=17.12，P<0.01)，PEDF药物治疗组MCP-1蛋白的相对表达量(0.30±0.15)较PBS治疗对照组(0.78±0.11)显著减少，差异有统计学意义(P<0.01)；PEDF药物治疗组MCP-1蛋白的表达量较正常对照组(0.28±0.10)升高，但差异无统计学意义(P>0.05，图5)。

RT-PCR检测结果显示，正常对照组、PBS治疗对照组、PEDF药物治疗组视网膜MCP-1 mRNA相对表达量分别为1、17.63±7.58、3.47±2.34，三组间差异有统计学意义(F=3.842，P=0.041)。PBS治疗对照组小鼠视网膜MCP-1 mRNA相对表达量较正常对照组增高，差异有统计学意义(P=0.019)；PEDF药物治疗组小鼠视网膜MCP-1 mRNA相对表达较PBS治疗对照组减少，差异有统计学意义(P=0.042)；正常对照组小鼠视网膜MCP-1 mRNA相对表达量与PEDF治疗组比较，差异无统计学意义(P=0.707，图6)。

图4RT-PCR检测正常组和OIR模型组视网膜PEDF和MCP-1mRNA相对表达量A：PEDF；B：MCP-1；aP<0.05，bP<0.01vsOIR模型组。

图5Westernblot检测各组视网膜MCP-1蛋白的相对表达量。

图6RT-PCR检测各组视网膜MCP-1mRNA相对表达量aP<0.05vsPBS治疗对照组。

3讨论

诸多致盲性眼病如年龄相关性黄斑变性、糖尿病视网膜病变、视网膜中央/分支静脉阻塞和早产儿视网膜病变等的病理基础在于视网膜膜微血管异常，缺血缺氧致RNV形成[5-6]。越来越多的研究表明，PEDF在缺血缺氧性视网膜病变中发挥重要作用[2,7]。同时关于炎症趋化因子MCP-1在缺血缺氧性视网膜病变中的作用也日渐显现[8-10]，PEDF作为抑炎因子，两者是否存在某种关联尚未阐明。本研究通过建立OIR小鼠模型模拟缺血缺氧性视网膜病变，再用重组PEDF玻璃体腔注射进行干预，观察PEDF对氧诱导视网膜新生血管形成及对炎症因子MCP-1表达的影响，并进一步探讨PEDF对缺血缺氧性视网膜病变的保护作用。

PEDF最初是从胎儿视网膜色素上皮细胞培养液中分离出来的一种糖蛋白，具有营养神经、抗炎等多种生物学作用而于近年来备受关注。既往研究证实PEDF具有促进视网膜和中枢神经系统神经元生长和分化的功能[11]，同时还具有抑制视网膜、玻璃体和角膜血管形成的作用[12]。组织中高水平的PEDF还可以抑制缺血性视网膜病变中的细胞凋亡、抑制视网膜和脉络膜新生血管的形成[13]。既往研究还发现视网膜细胞产生PEDF的量与氧浓度呈正相关[14]，但其机制尚不清楚。研究显示早产儿视网膜病变患者玻璃体中PEDF蛋白表达水平较对照组明显降低[15]。Notari等[16]利用动物和细胞模型证实缺氧显著下调由色素上皮细胞产生的PEDF，而这一过程是通过细胞外基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)介导的蛋白降解作用实现的，PEDF对于缺氧或血管内皮生长因子诱导的蛋白降解很敏感。PEDF的低表达进一步促进RNV的生成和神经节细胞的死亡。本研究中OIR小鼠视网膜PEDF的表达较正常组明显降低，同时病理性新生血管显著增生，这与既往研究相一致。

在实验性糖尿病视网膜中，PEDF作为眼内最强的抑炎因子之一，能够减少促炎因子的表达[17]。而多种视网膜病变的病理过程往往有免疫炎症因素参与。我们前期研究[18]表明，缺氧情况下PEDF可能通过下调视网膜Müller细胞中白细胞介素1-β的表达，上调Müller细胞谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)和谷氨酸/天冬氨酸转运体(glutamate/aspartate transporter，GLAST)的表达，从而改善谷氨酸循环而发挥神经保护作用。同时缺氧情况下PEDF可能通过下调视网膜白细胞介素1-β的表达，以抑制RNV的形成[3]。Park等[19]利用大量表达PEDF的转基因小鼠制作OIR模型，研究发现氧诱导后的PEDF转基因小鼠视网膜RNV和视网膜炎症因子较氧诱导后的野生小鼠明显减少。在激光诱导脉络膜新生血管模型中，与野生型小鼠相比，PEDF转基因小鼠视网膜中炎症因子、血管内皮生长因子、细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1，ICAM-1)、MCP-1、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(tumour necrosises factor-α，TNF-α)和结缔组织生长因子(connective tissue growth factor，CTGF)mRNA表达明显降低。其中趋化因子MCP-1具有趋化单核细胞和T淋巴细胞聚集并激活单核细胞和巨噬细胞的作用，其不仅是参与炎症的重要因子，还参与正常血管的发育和病理性新生血管的形成[20]。糖尿病视网膜损伤中单核细胞与巨噬细胞聚集，促进糖尿病视网膜病变的进展[21]。而且，玻璃体中MCP-1的表达水平与PDR的严重程度密切相关[8]。Yoshida等[9]研究显示，缺血性视网膜病变中MCP-1和巨噬细胞炎症蛋白-1α(macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α)与RNV形成有关，同时两者还参与了炎症反应的过程。董宁等[10]研究证实，小鼠视网膜发育过程中始终伴随着MCP-1的表达，MCP-1的表达上调可能与小鼠视网膜血管发育和OIR模型中RNV的形成密切相关。本研究亦显示OIR小鼠于17日龄时视网膜MCP-1蛋白与mRNA表达较正常组均上调。

结合PEDF的抗新生血管形成及其抑炎作用，那么缺血缺氧条件下PEDF能否抑制视网膜MCP-1的高表达？为此，本研究采用玻璃体腔注射的方法对OIR小鼠视网膜进行PEDF干预，结果显示其较PBS治疗对照组MCP-1表达水平明显降低、新生血管面积显著减少，提示在缺血缺氧环境下，PEDF能够抑制视网膜MCP-1的高表达，而且PEDF可能通过下调MCP-1的表达而减弱或抑制RNV的形成。既往研究显示，与对照组病例相比，PDR患者和糖尿病黄斑水肿患者玻璃体中均有高水平的IL-6、MCP-1和VEGF蛋白表达量，而PEDF蛋白表达量则显著下调[22-23]。同时在DR动物模型中，玻璃体腔注射低剂量的PEDF即可降低视网膜血管通透性，而且PEDF玻璃体腔注射组较对照组视网膜中炎症因子VEGF、ICAM-1和MCP-1水平均有明显的降低[17]，这与本研究结果一致。现有研究证实葡萄膜炎患者房水中PEDF的表达水平亦与MCP-1密切相关[24]；在培养的人微血管内皮细胞中，PEDF抑制晚期糖基化终产物诱导的活性氧生成以及后续MCP-1 mRNA和蛋白的高表达，而PEDF的替代物可以通过抑制晚期糖基化终产物的不利因素来抑制DR的发展进程[25]。因此，缺血缺氧条件下，PEDF可能通过抑制MCP-1的表达从而减弱或抑制单核细胞与巨噬细胞聚集，最终发挥其抑制RNV形成的作用。

综上，本研究利用OIR小鼠模型观察了缺血缺氧环境下PEDF对RNV的形成和MCP-1表达的影响，证实了PEDF能够下调氧诱导视网膜病变中视网膜MCP-1的表达，这可能是其抑制RNV形成而发挥视网膜保护作用的机制之一。这为将来寻找RNV潜在治疗靶点提供了新的思路。但本实验还存在一些缺陷，比如尚缺乏PEDF对MCP-1相关效应细胞的影响以及MCP-1诱导RNV形成的直接证据，因此需要更深入的研究。