超高效液相色谱-串联质谱法检验腐败血中吗啡和6-单乙酰吗啡

吕昱帆, 王继芬*, 常 靖, 李 超, 彭山珊

(1. 中国人民公安大学刑事科学技术学院, 北京 100038; 2. 公安部物证鉴定中心, 北京 100038)

海洛因,即二乙酰吗啡,是目前滥用最广泛的半合成鸦片类毒品。尽管近年来新型毒品层出不穷,但根据联合国世界毒品报告,海洛因全球滥用人数仅次于大麻和可卡因,且近4年来人数有上升趋势。由于海洛因摄入方式多为注射,海洛因滥用人群中发生HIV病毒感染和注射过量死亡事件的风险更高[1,2]。海洛因进入人体后的半衰期仅为3 min,会迅速代谢为具有活性的6-单乙酰吗啡(6-MAM)[3]和无活性的3-单乙酰吗啡(少量),此后单乙酰吗啡进一步降解为吗啡,上述代谢物进入肝脏后与蛋白质结合,形成相应的葡萄糖醛酸结合物[4]。目前对海洛因摄入的确认,多采用同时检验血液、肝脏中6-单乙酰吗啡和吗啡的方式。腐败检材中毒品的检验一直是实际工作以及世界法庭毒物学中的难题,腐败检材基质效应大,提取回收率低,常规的检验方法无法满足实践中检验腐败检材中毒品的要求。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Shimadzu Nexera 30A-LC超高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司); API 5500 QTRAP®三重四极杆质谱仪(美国AB SCIEX公司); Analyst工作站(美国ABSCIEX公司);台式高速冷冻离心机(美国Thormo Fisher科技公司); Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)。

乙腈、甲醇、甲酸(HPLC级,美国Fisher公司); 10%(v/v)氨水(HPLC级,美国Mreda公司);无水硫酸镁、无水氯化钠、无水乙酸钠(分析纯,国药集团); C18SPE吸附剂(美国Agilent公司);N-丙基乙二胺(PSA)吸附剂(天津Agela科技公司);石墨化炭黑(GCB)吸附剂(美国Sepax科技公司)。

标准对照品:吗啡盐酸盐、6-单乙酰吗啡盐酸盐,由公安部禁毒情报中心提供。

空白血由首都医科大学附属复兴医院提供。

1.2 标准溶液配制

标准储备液:分别准确称量5.00 mg吗啡盐酸盐和6-单乙酰吗啡盐酸盐,用甲醇溶解定容至5.00 mL,配制成1.00 g/L的标准储备液,于-20 ℃条件下保存。混合标准溶液:分别吸取适量标准储备液,用甲醇稀释,配制成质量浓度为20 mg/L的混合标准溶液,于-20 ℃条件下保存。系列混合标准工作液由混合标准溶液用甲醇逐级稀释配制而成,现用现配。

1.3 腐败血制备

将新鲜空白血置于25 ℃恒温箱中,取下密封盖使血液与空气直接接触,模拟血液在一般室温条件下腐败的情况,分别于10天、20天、30天后取出,于-20 ℃冷冻备用。随腐败时间的延长,可观察到血液黏度增大,颜色由鲜红变为暗红以至褐色,有动物组织腐败的臭味。

1.4 样品前处理

取0.5 mL空白血于15 mL离心管中,添加10 μL混合标准溶液,涡旋10 s后静置1 min,使标准溶液与空白血充分混合。

向上述加标样品中加入2 mL乙腈-水混合溶液(4∶1, v/v),并加入30 mg氯化钠和60 mg无水硫酸镁,振荡10 min,充分混匀。在8 000 r/min下离心10 min,将上清液转移至另一15 mL离心管中,加入25 mg PSA和25 mg无水硫酸镁,涡旋10 s,充分混匀后在8 000 r/min下离心5 min。取上清液过0.22 μm有机膜过滤,滤液供UPLC-MS/MS分析。

1.5 分析条件

1.5.1质谱条件

采用电喷雾离子源正离子(ESI+)模式,多反应监测(MRM)扫描模式;离子源电压(IS): 5 500 V;离子源温度(TEM): 650 ℃;气帘气(CUR)压强:0.30 MPa;雾化气(GS1)压强:0.50 MPa;辅助气(GS2)压强:0.55 MPa;碰撞气(CAD)强度:Medium。

吗啡和6-单乙酰吗啡的质谱优化采集参数见表1。

表 1 吗啡和6-单乙酰吗啡的质谱参数Table 1 Mass spectrometry parameters of morphine and 6-monoacetylmorphine

*Quantitative ion.

1.5.2超高效液相色谱条件

选用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm),柱温40 ℃; 0.01%(v/v)氨水(A相)和乙腈(B相)作为流动相,流速0.4 mL/min。采用4 min梯度洗脱模式:0.0～0.1 min, 10%B; 0.1～1.2 min, 10%B～50%B; 1.2～2.8 min, 50%B; 2.8～2.9 min, 50%B～10%B; 2.9～4.0 min, 10%B。进样量为1 μL。

2 结果与讨论

2.1 仪器检测条件优化

2.1.1质谱条件优化

采用ESI+模式,使用注射针泵分别向质谱中注入吗啡和6-单乙酰吗啡,通过一级全扫描获取目标物的母离子[M+H]+,再通过二级质谱裂解分析,分别选出强度最高的3个子离子,与母离子组成3个离子对。进一步对选出的离子对进行碰撞能量、去簇电压等参数的优化,最终选定定性和定量分析离子。

2.1.2色谱条件优化

选用ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)进行分离。

实验比较了水(A相)和乙腈(B相)、0.1%(v/v)甲酸-水(A相)和乙腈(B相)、0.01%(v/v)氨水(A相)和乙腈(B相)3种流动相。结果表明,使用水(A相)和乙腈(B相)作为流动相时,吗啡和6-单乙酰吗啡响应低,且保留时间集中,无法分离;使用0.1%(v/v)甲酸-水(A相)和乙腈(B相)作为流动相时,两种化合物分离效果较好,但吗啡峰形过宽,无法达到分析检测的要求;0.01%(v/v)氨水(A相)和乙腈(B相)为流动相,目标物分离效果和响应强度均较好,色谱峰形对称、峰宽窄、干扰峰低。最终选择0.01%(v/v)氨水(A相)和乙腈(B相)作为流动相。

实验比较了4种梯度洗脱程序分离目标物的效果。(1) 0.0～0.1 min, 10%B; 0.1～1.2 min, 10%B～50%B; 1.2～2.8 min, 50%B; 2.8～2.9 min, 50%B～10%B; 2.9～4.0 min, 10%B。(2) 0.0～0.1 min, 10%B; 0.1～2.8 min, 10%B～80%B; 2.8～2.9 min, 80%B～10%B; 2.9～4.0 min, 10%B。(3) 0.0～0.1 min, 10%B; 0.1～0.9 min, 10%B～35%B; 0.9～3.0 min, 35%B～80%B; 3.0～3.5 min, 80%B; 3.5～3.9 min, 80%B～10%B; 3.9～4.0 min, 10%B。(4) 0.0～0.1 min, 5%B; 0.1～0.9 min, 5%B～25%B; 0.9～3.0 min, 25%B～50%B; 3.0～3.5 min, 50%B; 3.5～3.9 min, 50%B～5%B; 3.9～4.0 min, 5%B。实验结果显示,第1种梯度洗脱程序对目标物分离效果最佳。吗啡和6-单乙酰吗啡的色谱图见图1。

图 1 吗啡和6-单乙酰吗啡的MRM色谱图Fig. 1 MRM chromatogram of morphine and 6-monoacetylmorphine

2.2 QuEChERS前处理条件优化

腐败血中不仅含有大肠杆菌、大肠腐败杆菌、肠球菌等为主的活体细菌,还含有由于腐败产生的小分子胺类、醇类,以及大分子蛋白质、脂肪、多糖降解产物等[15]。由于基质复杂,腐败血样品检验分析结果往往回收率低、检出限高。本实验使用QuEChERS方法对腐败血样品前处理,萃取溶剂的优化已在此前发表的文章中阐述[24],此处不再赘述。

图 3 使用不同质量MgSO4时吗啡和6-单乙酰吗啡的回收率Fig. 3 Recoveries of morphine and 6-monoacetylmorphine with different amounts of anhydrous magnesium sulfate

2.2.1盐析剂优化

盐析剂的加入可促使萃取溶剂中的有机相与基质分层,促使目标物向有机相中转移。NaCl和MgSO4是QuEChERS方法中最常用的盐析剂,其中NaCl的盐析作用可提高极性物质的回收率,MgSO4则能够吸收有机相中多余的水分,提高目标物的回收率。除此之外,还有一些具有缓冲作用的盐析剂,如无水乙酸钠(NaAc)、无水柠檬酸钠(NaCit)等。实验比较了QuEChERS前处理方法中常用的盐析剂NaCl和具有缓冲作用的盐析剂NaAc对吗啡和6-单乙酰吗啡的提取效果,以回收率为评价指标。图2为加入不同质量NaCl和NaAc前处理后,吗啡和6-单乙酰吗啡的回收率变化情况。

NaCl作为盐析剂时,随加入的NaCl质量变化,吗啡和6-单乙酰吗啡的回收率变化趋势基本一致,且NaCl质量为30 mg时腐败血中吗啡和6-单乙酰吗啡的回收率均达到最高值,分别为80.9%和106.8%。无水NaAc作为盐析剂时,随NaAc质量变化,腐败血中吗啡和6-单乙酰吗啡的回收率变化趋势不一致,当加入无水NaAc 40 mg时,两者达到较高的回收率,分别为71.1%和84.1%。由此比较可以得出,NaCl作为盐析剂时的提取效果更优。

图 2 使用不同质量(a)NaCl和(b)NaAc时吗啡和 6-单乙酰吗啡的回收率Fig. 2 Recoveries of morphine and 6-monoacetylmorphine with different amounts of (a) anhydrous sodium chloride and (b) anhydrous sodium acetate (NaAc)

盐析剂除NaCl外,还应加入无水MgSO4以吸收有机相中的水分,并促使有机相与基质的分离。实验考查了无水MgSO4与NaCl质量比分别为2∶1、3∶1、4∶1、5∶1以及不加无水MgSO4时,腐败血中吗啡和6-单乙酰吗啡的回收率(见图3)。当加入不同质量无水MgSO4时,6-单乙酰吗啡的回收率在90%～110%之间波动,吗啡的回收率在加入无水MgSO460 mg时达到最高,为85.5%。

综合以上结果,实验最终以30 mg NaCl和60 mg无水MgSO4作为盐析剂。

2.2.2净化剂选择

腐败血中的脂肪酸、油脂等内源性物质较新鲜血更多,前处理应尽可能除去样品中的杂质以降低基质效应,同时最大限度保留目标物,保证较高的回收率。

图 4 使用不同净化剂时吗啡和6-单乙酰吗啡的回收率(n=5)Fig. 4 Recoveries of morphine and 6-monoacetylmorphine with different sorbents (n=5) PSA: primary secondary amine sorbent; GCB: graphitized carbon black sorbent.

CompoundLinear range/(μg/L)Linear equationr2LOD/(μg/L)LOQ/(μg/L)Morphine5-200y=102.2x+179.30.9998156-Monoacetylmorphine5-200y=193.35x+188.280.995715y: peak area; x: mass concentration, μg/L.表 3 吗啡和6-单乙酰吗啡在腐败血中的加标回收率(R)、基质效应和相对标准偏差(n=5)Table 3 Recoveries (R), matrix effects (ME) and RSDs of morphine and 6-monoacetylmorphine spiked in putrefied blood (n=5)Putrefied duration/dAdded/(μg/L)MorphineR±SD/%ME±SD/%Intra-day RSD/%Inter-day RSD/%6-MonoacetylmorphineR±SD/%ME±SD/%Intra-day RSD/%Inter-day RSD/%10 5103.44±0.1383.55±0.1610.310.7104.46±0.1883.04±0.059.112.3100102.43±0.0383.98±0.041.45.893.85±0.1089.69±0.039.72.420085.47±0.0984.36±0.0911.43.583.67±0.1494.04±0.0511.23.820589.43±0.1696.76±0.056.010.298.64±0.1884.94±0.025.28.110084.31±0.0584.32±0.0111.85.992.53±0.1991.09±0.0510.62.420081.84±0.15106.08±0.105.38.182.84±0.04107.61±0.046.68.830589.30±0.0685.60±0.0311.04.083.96±0.0598.66±0.025.17.610092.17±0.0598.34±0.033.63.281.22±0.0390.82±0.032.14.420090.04±0.0384.47±0.034.54.081.03±0.03100.14±0.025.18.8

实验比较了QuEChERS方法中常用的3种净化剂:C18吸附剂、PSA和GCB(见图4)。实验首先比较了净化阶段分别加入25 mg C18吸附剂、PSA和GCB时吗啡和6-单乙酰吗啡的回收率。实验结果显示,PSA作为净化剂时目标物回收率仍在较高水平,进而考察分别加入10、25和35 mg PSA时目标物的回收率。结果表明,PSA质量为25 mg时,吗啡和6-单乙酰吗啡的回收率更高,且此时基质效应为80%～110%。在此基础上再加入25 mg MgSO4,目标物回收率仍保持在较高水平,基质效应有所减小,为84%～107%。因此,实验最终确定以25 mg PSA和25 mg MgSO4作为净化剂。

2.3 方法学考察

2.3.1线性范围与检出限、定量限

在优化的实验条件下进行方法评价。取空白全血8份各0.5 mL,添加10 μL适当质量浓度的吗啡和6-单乙酰吗啡混合标准溶液,分别配制成0.5、1、5、10、20、50、100、200 μg/L的加标血液样品,按1.4节前处理方法操作,再进行UPLC-MS/MS分析。以目标物的质量浓度(x, μg/L)和峰面积(y)进行线性回归,以3倍信噪比(S/N)对应的添加水平作为检出限(LOD),以10倍S/N对应的添加水平作为定量限(LOQ),结果见表2。

2.3.2回收率、基质效应与精密度

分别取腐败程度不同的血液样品,添加低、中、高3个水平(5、100、200 μg/L)的混合标准溶液,按照1.4节方法前处理,以选定的仪器条件进行检测。通过对比峰面积平均值计算回收率(R)和基质效应(ME):R=Z/Y×100%, ME=Y/X×100%;其中X为仪器分析标准品溶液所得峰面积,Y为空白血样经前处理提取净化后加入混合标准品溶液分析所得峰面积,Z为添加混合标准品溶液后的血样经前处理提取净化后仪器分析所得峰面积[25]。结果见表3。

2.4 动物实验样品检测

取3只雄性成年SD大鼠,体重分别为146、150、144 g,依次编号1、2、3。1号鼠为空白,2号和3号分别尾静脉注射0.46 mg海洛因(生理盐水稀释至1 mL)。给药后2小时采用断头法处死并取血、取肝脏。样品采集后置于-20 ℃冰箱中备检,同时取部分2号、3号大鼠血、肝脏于25 ℃恒温箱中腐败20天。

按本研究优化后的方法对1、2、3号大鼠新鲜血和肝脏样品,2、3号大鼠腐败20天血和肝脏样品进行检验。1号空白大鼠血液及肝脏样品中未检出吗啡和6-单乙酰吗啡;2、3号大鼠新鲜血中吗啡浓度分别为20.1、26.5 μg/L;腐败血中吗啡浓度分别为2.1、2.8 mg/L。2、3号大鼠新鲜肝脏样品中吗啡浓度分别为642.4、537.8 μg/kg;腐败肝脏样品中吗啡浓度分别为825.4、844.3 μg/kg。上述血液和肝脏样品均未检出6-单乙酰吗啡。

针对上述动物实验样品检验未检出6-单乙酰吗啡的现象,依据Rook等[26]的研究,6-单乙酰吗啡在生物体内半衰期为21.8 min,且依据陈跃等[27]的研究,摄入较低给药量海洛因时,血液中海洛因代谢物6-单乙酰吗啡检测时限较短为1.5 h,此时样品中可能存在低于检出限浓度的6-单乙酰吗啡。而腐败前后吗啡的浓度变化与于晓巍等[28]研究结果一致,在较高温度时,6-单乙酰吗啡以较快速度降解成吗啡。

3 结论

本文改良了QuEChERS前处理方法,建立了同时检验腐败血中的吗啡和6-单乙酰吗啡的超高效液相色谱-串联质谱方法,有效降低了腐败血样品的基质效应,同时具有较高回收率,方法灵敏度高、准确可靠,能够快速准确地实现腐败血中吗啡和6-单乙酰吗啡的定量检验。该方法可为复杂的腐败生物样品中海洛因代谢物的检验提供解决方案,同时为疑难生物样品中其他毒品、药物成分的检验提供方法基础。