氟砷联合中毒动物模型建立的研究进展

张桥清，吴明松，刘建国，

(1.遵义医科大学附属口腔医院，贵州 遵义 563099；2.贵州省普通高等学校口腔疾病研究特色重点实验室暨遵义市口腔疾病研究重点实验室，贵州 遵义 563006)

据研究调查结果显示：氟中毒是由于过量摄入氟导致以牙齿和骨骼为主要病变的全身慢性蓄积性中毒，而砷中毒主要临床表现为皮肤三联征，包括皮肤色素脱失、色素沉着和掌跖部角化[1-2]。近年来，许多国内学者研究表明氟砷联合中毒的毒性主要表现为对消化系统、循环系统、泌尿生殖系统、神经系统和骨骼等的损伤，其对子代的生长发育也有一定影响[3]。氟砷联合中毒所导致的疾病称为“氟砷中毒综合征”，这种新的地方病已被中国、印度、日本、韩国、墨西哥和哥伦比亚等国家发现并得到广泛关注[4-5]。在我国，氟、砷中毒往往相互存在，地方性氟中毒和地方性砷中毒己被国家列为21 世纪重点防治疾病，而贵州、新疆等地属于地方性氟中毒和地方性砷中毒高发区[6]。为便于后续研究人员对氟砷中毒做更好的研究，本文就氟砷联合中毒的动物模型建立作一综述。

1 氟砷的吸收与排泄

氟和砷可通过消化道、呼吸道和皮肤等多种途径被人体吸收，其中消化道是最主要的吸收途径，研究表明水溶性氟几乎全部吸收，由于氟对骨骼和牙齿有特殊亲和力，95%以上吸收的氟分布在骨组织和牙齿当中，而砷在胃肠道吸收率为80%以上，然后经血液运送后主要蓄积在肝脏中[7-8]。氟与砷在肠道内均以离子形式被扩散吸收，氟化物在胃酸的作用下形成氟化氢，氟离子可以通过血液进入机体与血中的钙、镁离子结合，从而使得血液中钙离子、镁离子浓度降低，导致钙、镁代谢异常。砷进入血液后，砷可转化为氧苯砷与血液中血红蛋白的珠蛋白和细胞中酶结合，影响酶的活性，从而阻碍机体的代谢活动[9]。肾脏是排泄氟的主要器官，约85%的氟由肾脏吸收过滤后排出，肾脏是氟中毒后机体最容易受损的靶器官之一[10]。尿和粪便是氟和砷的主要排出途径，氟可较快由肾脏滤出，砷则与血红蛋白结合，存在于红细胞内，机体内的砷代谢过程主要以甲基化为主，经过氧化还原最终生成三价二甲基砷随尿被排出体外，还有其他少量的氟和砷经胆汁、乳汁、皮肤、汁腺、毛发、指甲和呼出气等排出体外[7，11]。

2 实验动物的选择

研究氟、砷中毒的实验动物种类、品系繁多，建立动物模型时应从相似性、重复性、适用性、可控性、易行性、经济性等条件出发。目前实验常用的动物有：大小鼠、裸鼠、豚鼠、家兔、恒河猴、比格犬以及小型猪等[12]，大小鼠价格低廉、易于大量繁殖、生活条件也容易控制，研究者选用成年大小鼠作为模型动物居多[13-16]。在建立氟中毒动物模型时，大小鼠有利于模拟人的受毒环境，因此成为实验室最常用的动物[17-18]。研究发现，小鼠对氟的敏感性差异较大，大鼠则较为敏感，且更容易饲养，故大鼠是最理想的氟中毒动物模型[19]。在研究砷的新陈代谢时，有研究表明，大鼠体内砷的含量比其它动物都高，且会影响砷的代谢，所以不建议使用大鼠作为动物模型[20]。为减少模型动物氟和砷代谢差异对实验的影响，研究以氟中毒为主导作用时(如砷对氟斑牙发生的影响)可使用大鼠作为模型动物；研究以砷中毒为主导作用时(如氟对皮肤三联征发生的影响)则可使用小鼠作为模型动物。Liu等[21]发现在实验动物中性别会对氟毒性存在差异，雄鼠通过尿排泄氟多于雌鼠，沉积在骨骼中的氟却高于雌鼠，并且雄鼠出现早期氟中毒的症状晚于雌鼠。至于具体选择哪种动物做为实验动物，应把所研究的药物在该种动物体内的吸收、分布、代谢和排泄与人类紧密联系起来，如在循环系统方面研究时可选择与人相似的犬、猴、猪，猴的神经系统发达且生殖系统与人类非常接近，也可用于行为学和生殖学的研究，犬的消化系统较为发达，可用于消化系统方面的实验。

3 实验试剂的选择

我国饮水及煤炭中富含氟、砷元素。氟能以液态、气态以及固态的形式存在于自然界中，液态和气态氟化物主要是氢氟酸(HF)，也可能有少量的氟化硅(SiF4)和四氟甲烷(CF4)，固态氟化物主要是氟化钠(NaF)、氟化钙(CaF2)、氟化铝(AlF3)、冰晶石(Na3AlF6)及磷灰石等。氟化钠在市场上购买简单、价格便宜，且在饲养所用的饮水中可直接进行添加，不需任何大型仪器，操作简单方便快捷，因此成为实验常用的试剂。砷广泛分布于自然界中，但很少以单质状态存在，其主要存在形式是砷的化合物。砷在化合物中的存在形式主要是三价砷和五价砷，三价砷化物比五价砷化物毒性更强致癌效应更高，三价砷约是五价砷毒性的60倍[22-24]。砷的化合物常见的有亚砷酸酥(砒霜、三氧化二砷)、砷酸酐、三氯化砷、亚砷酸钠、砷酸钠等。三氧化二砷应用广泛，在工业上可用于制造半导体、玻璃、搪瓷以及染料等；农业上可用于杀虫剂、消毒剂的制造；临床上可用于治疗白血病、骨髓增生异常综合征以及其它血液系统疾病，对恶性实体瘤(如肝癌、结肠癌等)也有很好的抗癌作用[25]，在口腔疾病中也起到一定的治疗作用(如牙髓失活、口腔肿瘤)。在氟砷联合中毒模型建立中建议使用氟化钠和三氧化二砷试剂。

4 氟砷中毒途径、时间及剂量

人体主要通过饮水、食物、呼吸道等途径摄入氟砷，Lewy等[26-27]研究表明,从牙膏中摄入过量的氟是牙齿患轻度氟斑牙的危险因素，药物治疗导致三氧化二砷含量过高也是砷中毒的常见原因。我国地氟病、地砷病的主要病因为饮水中含有过量的氟、砷，且饮水是氟砷中毒的主要途径，贵州和陕西等高氟高砷暴露区居民因长期使用无烟囱、无炉盖的地炉做饭和取暖，室内空气氟砷含量由煤炭燃烧释放增加，从而导致空气污染，室内煤炭烘烤食物是引起氟砷中毒的另一主要原因[28-29]。迄今为止，大多数动物模型的建立采用染毒方式以自由饮水为主。Yang等[30]在研究氟砷中毒对大鼠破骨细胞骨吸收能力的研究中用氟化钠和亚砷酸钠以灌胃的形式染毒，同样造模成功。李玲[31]通过复制改良高氟区燃煤方式，利用氟病区煤烘玉米，制造高氟空气环境，成功建立高仿真的燃煤型氟斑牙动物模型。研究报道[32-33]大鼠饮用氟浓度为100 mg/L、砷浓度为0.12 mg/L的水3个月可引起中毒，氟砷联合染毒采用不同的时间及剂量同样也可造模成功。Sárközi等[34]采用氟化钠组(5 mg/kg)、亚砷酸钠组(10 mg/kg)以及氟化钠和亚砷酸钠联合组研究氟、砷对运动行为与全身毒性的影响，以灌胃方式进行染毒，连续染毒12周后发现运动明显减少，体重增加。Zhang等[35]将SD大鼠分别自由饮用120 mg/L氟化钠、70 mg/L亚砷酸钠、120 mg/L氟化钠+70 mg/L亚砷酸钠水溶液，染毒3个月证实氟、砷及其联合作用可损害大鼠的空间学习记忆能力。

5 造模设计

研究者们对单独氟中毒及砷中毒模型的建立已有大量报道，顾何锋等[36]使用Wistar大鼠分为4组饮用氟化钠浓度分别为0、50、100、150 mg/L的自来水，8周后造模成功，大鼠切牙出现不同的氟牙症表现，血氟、牙氟、骨氟含量显著高于对照组，且随浓度增加而增加，牙齿和骨骼病理学改变加重。马栓柱等[33]用Wistar大鼠按砷的含量分为对照组(0 mg/L)、低剂量组(0.0012 mg/L)、中剂量组(0.012 mg/L)、高剂量组(0.12 mg/L)，自由饮水6个月，监测大鼠的基本生命指征，测定各组血、尿、毛发的含砷量，各项检测指标显示成功创建饮水型砷中毒大鼠模型。张杰[37]用2因素3水平的析因设计(低氟25 mg/(kg·d-1)、高氟50 mg/(kg·d-1)、低砷0.75 mg/(kg·d-1)、高砷1.5 mg/(kg·d-1)将SD大鼠分为9组，自由饮水染毒6个月后成功建立饮水型氟砷联合中毒动物模型。因氟砷联合中毒的主要方式以饮水为主，构建模型时以饮水方式为主。设计饮水型氟砷联合中毒模型时，可以采用析因设计分为不同组，自由饮用含氟(高氟150 mg/L、中氟100 mg/L、低氟50 mg/L)、含砷(高砷0.12 mg/L、中砷0.012 mg/L、低砷0.0012 mg/L)及其相应混合的水溶液，对照组饮用蒸馏水。因含氟组2个月可造模成功[36]，而含砷组2个月即可出现明显的砷中毒症状[33]，造模2个月后开始观察是否造模成功。由于燃煤是引起氟砷中毒的另一主要原因，氟砷联合中毒动物模型采用王光平和徐玉艳等[38-39]方法模拟病区居民生活习惯，复制高氟高砷空气环境，大鼠食用燃煤烘烤的玉米作为含不同浓度氟、砷的饲料，对照组食用普通玉米饲料，各组均自由饮用氟砷含量正常的自来水，同样采用析因设计分组，3个月后判断是否造模成功。

6 造模成功的判断

氟砷中毒一般分为急性氟砷中毒和慢性氟砷中毒。急性氟砷中毒以胃肠炎表现为主，出现呕吐和腹泻等临床症状，多于数小时内死亡。慢性氟砷中毒主要表现为对牙齿、骨骼、皮肤和神经的损害，如氟斑牙、氟骨症、皮肤等异常症状。因急性中毒发病症状明显，时间短，不难做出诊断；而慢性中毒发病症状不明显，时间长，且是最常见的类型，因此是动物实验研究的主要对象。判断氟砷联合中毒模型的建造是否成功，主要从成模时动物的一般状况，机体各组织器官氟、砷的水平和组织病理学检测等方面进行。造模成功时，动物主要症状表现为消化和神经功能异常，被毛无光泽、脱落，皮肤黏膜发炎，四肢无力、麻痹，皮肤感觉减退以及精神、食欲、活动和体重等异常[17，40]。牙、骨、皮肤等是氟砷作用的靶器官，氟砷中毒可以影响其正常矿化和代谢过程，并引起代谢和病理性变化，导致不同程度氟斑牙、氟骨病和皮肤损害的发生，氟砷含量是判定地方性氟砷中毒的重要指标[41-44]。氟砷含量的测定包括骨组织、血液、尿液、毛发、指甲(趾甲)、牙齿等，其中血液、尿液、骨组织、皮肤中氟砷的含量以及氟斑牙的临床症状是评判氟砷中毒动物模型构建成功的标准[43]。光镜及电镜下可观察到成秞细胞体积变小，细胞器减少，排列不规则、扭曲，排列多层，极性消失，间隙不规整，粗面内质网扩张明显，高尔基体萎缩、线粒体肿胀，胞浆内有基质小泡，Tome’s突不规则或消失[17]。

7 氟砷的相互作用关系

研究表明单独的氟和砷对细胞存活率的作用呈双向性，即氟和砷在低浓度下可促进细胞增殖，而在高浓度下却抑制细胞的生长[45-46]，加上机体各组织氟砷含量的分布、代谢与排泄不同，氟和砷存在多种相互作用关系。过量的氟和砷可以穿过血脑屏障在大鼠脑中蓄积，Jiang等[13]根据平均日摄水量，用体重280～300 g的大鼠每天摄取氟化钠12.0～12.8 mg/kg +亚砷酸钠7.0～7.5mg/kg，3个月后，大鼠血液、海马和皮质的氟砷含量显著高于未染毒大鼠，与单独氟或砷组相比，氟+砷组大鼠大脑皮层代谢型谷氨酸受体5 mRNA表达和海马代谢型谷氨酸受体5蛋白表达下调，表明氟砷这两种微量元素之间存在协同作用。Zhu等[14]在母鼠妊娠期和哺乳期饮用含氟化钠100 mg/L、亚砷酸钠75mg/L、氟化钠100 mg/L+亚砷酸钠75 mg/L的水溶液，仔鼠断奶后饮用与母鼠同样的溶液，第21天和42天仔鼠Morris水迷宫实验和免疫印迹法检测蛋白激酶、磷酸蛋白激酶、环腺苷酸反应元件结合蛋白和磷酸环腺苷酸反应元件结合蛋白表达，结果证实氟化钠和亚砷酸钠的相互作用关系为协同。Flora等[15]用雄性小鼠分别染毒亚砷酸钠50 ppm和氟化钠50 ppm及联合染毒10周，与单独氟砷染毒组比较，联合用药组超氧化物歧化酶和过氧化氢酶等的表达高于单独氟砷组，其相互作用结果表现为拮抗作用。但郑玉建等[6]用人的淋巴细胞进行单细胞凝胶电泳实验报道，氟化钠和亚砷酸钠均可引起细胞DNA损伤，氟化钠和亚砷酸钠在高浓度(0.5 μmol/L亚砷酸钠+50 μmol/L氟化钠)的剂量下，细胞DNA的损伤呈现出协同作用，而在低浓度(0.1 μmol/L亚砷酸钠+10 μmol/L氟化钠)的剂量下则表现为简单的相加作用。周远忠等[16]用小鼠以自由进食含氟化钠和三氧化二砷的饲料为模型，分为对照组(普通饲料)、氟中毒组(含氟量为16.844mmol/kg)、砷中毒组(含砷量为0.400 mmol/kg)、氟砷联合中毒组(含氟量为16.844 mmol/kg，含砷量为0.400 mmol/kg)，4组小鼠均自由饮用自来水12月，实验结果显示各组小鼠的大脑、肝脏、肾脏脂质过氧化含量升高，但其抗氧化能力降低程度尚未达到其分别作用之和，氟化钠和三氧化二砷之间无协同作用，但拮抗作用并不明显，也不能肯定具有拮抗作用。Sárközi等[34]用7周龄160g左右重量的Wistar大鼠以亚砷酸钠(10 mg/kg)、氟化钠(5 mg/kg)及其联合灌胃染毒(每日一次，每周5次，连续6周)的雄性大鼠为模型，研究亚砷酸钠和氟化钠对运动行为和全身毒性的影响，通过各项检测结果认为亚砷酸钠和氟化钠两者既不存在协同作用也不存在拮抗作用。氟砷联合中毒在机体不同系统中，二者的毒性损伤作用是明确的，但交互作用不尽相同，尚无定论。因此，氟、砷联合中毒的相互影响值得进一步深入探讨。

8 展望

目前关于氟砷联合中毒对牙齿影响的研究甚少，牙齿是机体对氟化物最为敏感的器官，氟斑牙为氟中毒最早出现的特异性体征，是人体慢性氟中毒最直观的表现。砷中毒对于氟中毒引起的氟斑牙是协同还是拮抗作用少见报道。氟砷联合作用于牙齿的模型建立不成熟，可以先从最为常见的饮水型氟斑牙动物模型开始，并建立多组联合用药观察其相互影响。此外，贵州和陕西等地是高氟高砷暴露区，燃煤导致氟斑牙的发生也是常见原因，燃煤型氟斑牙动物模型的建立也值得深入研究。研究者们应当建立更好、更合适的动物模型，为氟斑牙以及其它疾病的研究提供更可靠的动物模型。