龟鳖类的性别决定机制研究进展

陈贞年，王晓清

（1.湖南农业大学动物科学技术学院，湖南 长沙 410128；2.水产高效健康生产湖南省协同创新中心，湖南 常德 415000）

性别决定与性别分化机制一直是动物学领域的热门课题，人们不间断地在动物性别控制领域投入大量精力，探索如何更加高效地控制其性别。近三十年来，随着分子遗传学和现代分子生物技术的迅速普及、发展、完善。人们对性别决定机制的认识逐渐深入到细胞水平，发现了与性别控制有直接关系的染色体——性染色体，这使得从基因水平上研究和控制动物的性别成为可能。

1 爬行动物性别决定研究进展

在脊椎动物中，人和哺乳类的性别决定机制已经做了大量研究，也取得了一些成果。但迄今，仍未解析出很多动物的性别决定机制，龟鳖类就是一例。

爬行动物的胚胎在发育过程中，要经历性别决定和性别分化这两个阶段。性别决定是指胚胎原始生殖腺受体内遗传物质影响而向精巢或卵巢发育的过程[1]，而性别分化则是指建立起次级特征的全部形态变化及生理变化差异。目前，爬行动物的性别决定类型可划分为两大类：一类是基因型性别决定（Genetic sex determination,GSD），指源于性染色体上的性别决定基因先导调控并诱导相关性别决定基因级联反应的过程，最终调控原始生殖腺朝精巢方向或卵巢方向定向发育的过程。爬行动物的基因型类型可分为：①XY型，XY表现为雄性，XX表现为雌性；②ZW型，ZZ表现为雄性，ZW表现为雌性。另一类是环境型性别决定（Environmental sex determination，ESD），指后代的性别分化不依赖遗传物质的组成，而是受控于胚胎发育时的环境因子（如温度、光照、湿度、类固醇激素等），最典型的环境型性别决定是温度依赖型性别决定（Temperature-dependent sex determination，TSD）。

自从1962年Becak首次在爬行动物中发现异型染色体之后，人们也渐渐地在其他爬行动物中发现了性染色体的存在，其中分化程度最为明显的是蛇类，属于ZW/ZZ型。Schartl[2]调查发现，蜥蜴目7科70多种都存在性染色体，一部分属于ZW型，一部分属于XY型。在龟鳖目中，北美泥龟科十字龟属中的两种（S.valvini、S.tripocatus）具有 XX/XY 型性染色体[3]。

2 温度对性别决定的研究

在爬行类、两栖类和少数鱼类中普遍存在温度依赖型性别决定[4-6]。Charmier[7]在1966年首次报道爬行动物性别受孵化温度的影响，Pieau[8]在后续研究中发现温度是影响性别决定的主要因子，并提出了温度依赖型性别决定类型。Bull等[9,10]研究了5种龟类的性别后提出了TSD机制。Ewert等[11]将温度依赖型性别决定分为三种：①MF（TSDⅠa）型，指低温产雄性，高温产雌性；②FM（TSDⅠb）型，指高温产雄性，低温产雌性；③FMF（TSDⅡ）型，指低温和高温均会产雌性，而中间温度则产雄性。而朱新平等[12]的研究则表明，黄喉拟水龟Mauremys mutica Cantor的性别决定属于TSD机制，为TSDⅠ型，其临界温度值为29℃。与黄喉拟水龟相同，珍珠鳖Apalone ferox Schneider的性别决定也属于TSD机制，为TSDⅠa型，即高温产雌性，低温产雄性，其临界温度值为28℃[13]。

近年来，随着分子遗传学和分子生物学技术的普及与发展，龟鳖类性别决定的关键基因渐渐被发现与克隆，在龟鳖类的TSD机制研究上也取得了新进展[14,15]。研究发现，龟鳖类性腺中的Dmrt1、Sox9、Mis、Sf1、Amh、Dax1、Wt1 和 Foxl2 等性别决定基因受温度因子的调控。当温度改变时，这些关键调控因子也会做出相应的变化[16-18]。

在TSD类型的爬行动物中，性腺发育有个特殊的温度敏感期（Temperature sensitive period，TSP），指动物胚胎发育到某特定阶段时，孵化的温度对性别起到决定性作用，这是动物胚胎性别出现逆转的特殊时期[19,20]。温度敏感期一般是在整个胚胎孵化周期的前1/3时期（第14～21期内）。动物温度敏感期存在种间差异，同一种动物的温度敏感期也存在性别差异。例如，淡水龟鳖类的胚胎发育周期可分为27期，海龟的胚胎发育周期可分为31期[21]；红耳龟Trachemys scripta雄性周期在16～21期，雌性周期在 17～19 期[22]；Tokita 等[23]将中 华 鳖 Pelodiscus sinensis从神经胚到出壳期划分为23期，划分从孵化的第2d（第5期）开始，至孵化的第48d（第27期）结束；锦龟Chrysemys picta的敏感温度期在第16～22期，若孵化温度低于25℃，温度敏感期可能在16期前并影响性腺的分化[24]；谢万奎[25]研究发现，欧洲甲鱼的性别分化对温度的敏感度特高，不同的孵化温度直接影响子代的性别，孵出不同性别的稚鳖。

3 温度对中华鳖性别决定的影响

目前对孵化温度与中华鳖性别决定的关系做了很多研究，但结果仍存在较大争议。朱道玉和孙西寨[26]研究发现，在24～34℃时，随孵化温度的上升雌性率降低，雄性率升高，温度24℃时，雌性率最大，温度32℃时，雄性率最大。孙西寨[27]和唐瑶[28]的实验也得到相同的结果，认为中华鳖属于温度依赖型，而不依赖于遗传物质决定。阮成旭和袁重桂[29]发现，在32℃下孵化的中华鳖雄性率高达72.1%，而在27℃下孵化，雄性率只有42.3%，调控孵化温度可以改变中华鳖的性别比例。巫旗生等[30]发现，调控孵化温度可以调控中华鳖胚胎的性别分化，子代雄性率随温度升高而上升，雌性率随着温度升高而降低。高丽丽[31]根据360枚中华鳖卵孵化的结果推断中华鳖属于温度依赖型性别决定机制。

而聂刘旺等[32]的研究结果却与朱道玉等的结果相反，他发现中华鳖的性别分化受孵化温度影响为MF型，即随着温度的升高，雌性率上升，雄性率降低。罗曼等[33]发现孵化温度在24～26℃时，孵出稚鳖的雄雌比大于1，而孵化温度在27～29.5℃时，孵出稚鳖的雄雌比小于1，观察体细胞没有发现异型染色体。任少亭等[34]的实验结果也验证了罗曼等的观点。

研究表明，龟鳖类中存在TSD性别决定机制[35-39]。贺斌等[40]研究发现，温度影响 Sf1、Mis、Sox9、Dax1、W t1和Dmrt1等参与龟鳖类的性别分化基因的表达。而李慧君[41]则认为中华鳖中有些基因的表达受温度因子调控，但孵化温度与性别决定之间的联系、以及温度调控相关性基因表达的机制还有待进一步研究证实。

4 雌雄激素对龟鳖类性别分化的影响

龟鳖类胚胎随着发育，双向潜能性腺在经历髓质的发育和皮质的退化后形成精巢；而双向潜能性腺在皮质的发育和髓质的退化后则形成卵巢[42]。雌激素对整个胚胎发育过程起重要作用，雌激素能促进性腺皮质发育，抑制髓质发育，影响胚胎的性腺分化[43,44]。研究表明，在雄性孵化温度条件下，将雌二醇激素注入菱斑龟Malaclemys terrapin、密河鳄Alligator mississippiensis、恒河鳄 Gavialis gangeticus的胚胎，可诱导胚胎性腺朝向卵巢方向分化[45]。叶玉珍等[46]实验发现，甲基睾丸素具有促使中华鳖胚胎性别趋向雄性转化，而唐瑶[28]则认为甲基睾酮并不能改变中华鳖个体自身性别分化方向，更不能使仔稚鳖发生性逆转，可能只对个体的生长发育有一定的促进作用。胡增高[47]研究了中华鳖血浆中性激素含量的季节性变化，发现雄中华鳖在发情高峰期血浆中性激素含量最高；乌龟、黄喉拟水龟和中华鳖的性激素季节性变化比较发现，雌性中华鳖血浆中雌二醇含量随卵巢卵泡的增长和发育而逐渐提高，当卵巢发育成熟时血浆中雌二醇含量达到最大值，而雄性中华鳖在繁殖期血浆睾酮含量高，说明睾酮对精子的形成与成熟至关重要。雄黄喉水龟中睾酮激素含量最高，中华鳖中含量最低；雌中华鳖中雌二醇激素含量最高，乌龟中含量最低[48]。于文萍[49]的研究也发现，中华鳖睾酮与生精作用和卵泡生长密切相关，而卵黄的形成和精原细胞、精母细胞以及精子的发育成熟均离不开雌二醇的作用。在整个胚胎性腺发育过程中，AR、ERα和芳香化酶的表达贯穿始终，说明在性腺分化前，雄激素、雌激素和芳香化酶就已经开始发挥作用[49]。Parker等[50]在分子水平上发现，Sf1能控制细胞表达性腺类固醇激素发生酶，其中包括芳香化酶在内。王莉等[51]发现，雌激素一方面是通过抑制Dmrt1和Sox9这两个雄性因子表达来抑制胚胎向雄性分化，又促进卵巢的生长发育，促使胚胎向雌性发育，揭示雌激素对中华鳖胚胎性别分化的调控作用。

5 有关性别遗传决定机制的研究

近年来，已有研究表明，中华鳖存在微小性染色体（Z/W），属于GSD机制[17,52-55]。在中华鳖33对染色体中，1～6号为大型染色体，其余均为小型染色体。各种实验也证实了这一发现，Kawai等[53]运用荧光原位杂交（FISH）定位技术，在中华鳖中发现了异性染色体；Badenhorst等[56]通过同源染色体配对表明，中华鳖和刺鳖Apalone spinifera均存在异性染色体（ZZ/ZW）。Literman等[57]通过实时定量PCR来鉴定中华鳖性染色体型。唐伟等[58]采用秋水仙素处理和核型分析验证中华鳖性染色体型为ZZ/ZW型（ZZ型为雄性；ZW型为雌性），并得出其核型公式为2n=66=4m+4st+34sm+22T+ZZ/ZW。

在性别调控关键基因的研究中，孙伟等[59]和蔡晗等[60]通过慢病毒介导鉴定了Dmrt1和Amh基因为中华鳖雄性分化的关键基因。包海声等[61]实验发现，在中华鳖性腺分化前Cyp19a1在雌性中特异性表达，经过芳香化酶抑制剂（AI）处理及Cyp19a1-shRNA处理后，ZW型的胚胎性腺皮质区渐渐退化，而髓质区却高度发育，最终形成原始性索结构，表现出由雌性向雄性发育的性逆转现象。认为Cyp19a1是调控卵巢早期分化的重要因子，在启动雌性分化通路中起关键作用。Matsumoto等[62,63]发现，Cyp19a1在雌红耳龟性腺分化关键时期中大量特异性表达。转录因子结合位点分析发现，Dmrt1和Foxl2与Cyp19a1密切联系，Dmrt1和Foxl2可直接调控Cyp19a1。Shoemaker等[64]发现，在巴西龟的温度敏感早期，胚胎的性腺中都检测到Sox9的表达。但到了温度敏感的中后期就出现了表达差异，表现为在雄性性腺中Sox9表达显著上升，在雌性中显著下降。这表明Sox9对于胚胎精巢的生长发育至关重要，对胚胎的性别分化有一定的影响。在八孔海龟Lepidochelys olivacea的性别决定中后期，Sox9在雄性性腺中高度特异性表达，被认为是雄性性别分化的关键基因之一[65]。Barske等[66]用β-雌二醇处理巴西龟胚胎，使在雄性温度下形成的胚胎发生性逆转，对比发现，Sox9在雌性中的表达水平显著降低。实验结果表明，内源性雌激素抑制了Sox9的表达，促使性腺向雌性发育。Matsumoto等[67]用芳香化酶抑制剂诱导雌性温度下的胚胎向雄性发育，并检测到Sox9的表达水平显著上调。Dmrt1在红耳龟Trachemys scripta和太平洋丽龟Lepidochelys olivavea等龟鳖类胚胎中的表达存在显著差异[68,69]，即在雄性中的表达显著高于雌性。牟毅[70]发现，孵化温度对中华鳖的性别无显著影响，比较基因组杂交结果显示，在两个争议种群的雌性成体中具异型性染色体，表明这两个种群的性别决定为GSD且属ZZ/ZW系统；并提出了新的假说——有效雌二醇积累（sumeE2）阀值假说，合理的阐释了温度对爬行动物胚胎性别的决定作用。

6 小结

爬行动物的性别决定过程是一个复杂的、多个性别相关基因精确调控以及有多种激素参与的过程，性别调控关键基因的筛选和功能鉴定是解析性别决定分子机制的关键。目前龟鳖类性别决定相关基因功能的研究还较薄弱，尚未建立温度、激素以及基因三者的级联作用模型。随着分子遗传学和分子生物学技术的普及、进步、完善，相信不久的将来一定可以解析其性别决定分子机制。