葡萄霜霉病抗性育种研究进展

付晴晴，褚燕南，王跃进，徐炎*

（西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100）

葡萄霜霉病（Grape downy mildew）是由葡萄霜霉菌[Plasmopara viticola(Berk. & M. A. Curtis)Berl. & De Toni]引起的典型流行性病害[1]，遍及世界各葡萄产区，以多雨潮湿地区发生普遍[2-3]，是危害葡萄最重要的病害之一。葡萄霜霉菌多侵染葡萄叶片，也可感染新梢、幼嫩果实等组织，病菌从侵入寄主到发病仅需3～5 d，在条件适宜情况下，从田间出现中心病株到大面积爆发只需10～15 d[4-5]。据国际葡萄与葡萄酒组织（OIV）数据显示，中国2018年的葡萄种植面积达87.5万 hm2，占世界葡萄种植面积的12%，仅次于西班牙，而葡萄产量居于世界首位[6]。目前，有关葡萄霜霉病传入我国的时间和途径尚不清楚，但最早的记载出现于1899年。现在霜霉病在我国各葡萄产区均有分布，以河北和山东发病最为严重，引起的葡萄减产在一般年份约有10%～20%，而在霜霉病流行年份能达到50%～80%，甚至绝产[7]，给葡萄生产造成严重经济损失。在新世界酿酒葡萄产区澳大利亚，平均每年因葡萄霜霉菌造成的产业损失高达6300万美元[8]，相当于澳大利亚葡萄生产总值的1%[9]。生产上的一些农业手段包括夏季修剪、提高结果部位、合理负载量、科学肥水管理、冬季清园以及采用避雨栽培等措施虽然能在一定程度上减轻葡萄霜霉病的爆发，但由于化学药剂具有见效快、效果显著、使用方便等特点，所以，目前防治葡萄霜霉病依然过度依赖化学杀菌剂的使用。欧盟统计局2007年的统计结果显示，在1999—2003年，欧洲葡萄的栽培面积仅占总种植面积的5%，然而却使用了近60%的杀菌剂[10]。值得注意的是，化学农药的长期使用既危害环境又耗费人力物力，并且化学农药极易导致霜霉菌产生耐药性，对防治病害带来严峻挑战[11-12]。选用抗性品种是葡萄霜霉病防治的重要途径，也是最为经济有效的方法[13-14]，而开展葡萄霜霉病的抗性研究及抗病机理探讨，对指导葡萄抗病育种具有重要意义。本文根据前人的研究报道，对葡萄霜霉菌的研究现状进行了分析探讨。

1 不同野生种葡萄对霜霉菌的抗性

葡萄不同种类对霜霉菌表现出较大的抗性差异[15-17]。大量研究表明，欧洲葡萄（V. viniferaL.）栽培种均不抗霜霉病。因此，在葡萄属的野生种中寻找抗病资源成为各国学者的研究热点。原产美洲的圆叶葡萄（Muscadinia rotundifoliaMichx.）虽然对霜霉菌免疫[18-20]，但远缘杂交不亲和限制了其进一步发展。中国是葡萄属野生种的重要起源地之一，拥有丰富的抗病种质资源，贺普超等[21]对我国葡萄野生资源进行了收集和保存，并通过田间调查和接种，以及室内离体接种等方法研究了中国野生葡萄对霜霉病的抗性。结果表明，对葡萄霜霉病的抗性在不同株系间存在显著差异，其中复叶葡萄‘留坝-8’（V.piasezkii accessionLiuba-8）、瘤枝葡萄‘岚皋-5’（V.davidiivar.Cyanocarpa accessionLangao-5）为高抗葡萄霜霉病株系；华东葡萄‘白河-35-1’（V. pseudoreticulata accessionBaihe-35-1）为抗霜霉病株系[15,21-22]。Liu等[23]和Yin等[24]通过苯胺蓝和3-二氨基联苯胺（diaminobezidin，DAB）染色等方法发现与欧洲葡萄‘黑比诺’相比，高抗霜霉病的‘留坝-8’和‘岚皋-5’菌丝生长缓慢，孢囊梗和孢子囊的萌发量较少，侵染位点周围有大量的胼胝质沉积和H2O2的积累，进一步验证了前期贺普超等人的研究结果。原产于东亚的山葡萄对霜霉菌抗性也表现出明显差异[25]，通过叶圆盘接种试验表明，山葡萄‘左山二’（V. amurensis Rupr. cv. Zuoshan-2）对葡萄霜霉菌有一定抗性，而山欧杂交种‘左优红’表现易感霜霉菌[26]。

2 葡萄对霜霉菌抗性机理

2.1 植物-病原菌互作机理

植物病原菌进化出多种策略以侵染寄主，例如粘附于植物表面、消除或逃避植物响应感染产生的防御分子以达到侵染目的[27]。同时，植物进化出精密的防御系统，从而识别病原菌分子并产生防御反应。植物具有不同的组成型防御机制，如细胞壁和角质层作为物理屏障以逃避病原菌入侵[28-29]。一旦植物的结构屏障被破坏，植物便通过诱导防御反应防止病原菌进一步入侵[30]。

植物已经进化出两层防御系统：首先，通过寄主细胞表面的模式识别受体（pPRR）、识别微生物相关分子模式（MAMP）或病原菌相关的分子模式（ PAMP），即PAMP-激发的免疫（PTI）或MAMP-激发的免疫（MTI）[31-32]。PTI启动一系列基础防御，包括活性氧（ROS）积累以及胼胝质沉积来增强细胞壁[33-34]。然而，一些病原菌进一步进化以释放抑制PTI的效应因子，破坏寄主免疫反应从而促进病原菌定殖[35-36]。在宿主与病原菌的进化斗争中，植物进化出第二层防御系统，通过细胞内受体识别胞内效应因子，触发效应因子激发的免疫（ETI）反应[37-38]。细胞内受体主要是富含核苷酸结合-亮氨酸重复（NB-LRR）的R蛋白，通过复杂的机制直接或间接识别病原菌效应因子[37]。R蛋白一旦被效应因子激活，便可引起强烈的防御反应，包括ROS快速爆发、水杨酸积累、侵染位点的过敏反应（HS）及病程相关蛋白（PR）基因上调表达。ETI启动与复杂防御信号传导途径网络相关，导致防御性细胞反应和大规模转录重编程事件[39]。

2.2 葡萄抗霜霉病基因功能分析

相较于欧洲葡萄，美洲葡萄及中国野生葡萄具有更高的葡萄霜霉菌抗性。基于此，国内外学者利用组织学、细胞学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等方法研究了葡萄-葡萄霜霉菌互作关系，揭示了葡萄抗霜霉病作用机制。

植物通常利用多种因子相互作用共同抵抗病原菌入侵。大量研究发现，葡萄叶片和浆果中的白藜芦醇、紫檀芪、ε-和δ-葡萄素能够抑制葡萄霜霉菌生长[40-43]。另外，木质素和萜类化合物也在抗葡萄霜霉病反应中发挥重要作用[44-46]。

近年来，转录组、蛋白组和代谢组学的出现加速了葡萄与葡萄霜霉菌互作的研究。Figueiredo等[47]通过转录组和代谢组分析发现，抗病葡萄中编码枯草杆菌蛋白酶、苯丙氨酸裂解酶、S-腺苷甲硫氨酸合酶、类WD-重复蛋白和J2P基因表达上调，以及肌醇和咖啡酸的积累。接种葡萄霜霉菌的山葡萄‘左山-1’（V. amurensisRupr. cv. Zuoshan-1）已通过转录组测序鉴定出一系列可能引起寄主抗性的基因和通路，这些基因包括CHI4D、TL3、PR10、CYSP、ERF4、STS5、THX、SHM1、HypP、GLO、ClpP等，涉及的途径与核糖体结构、光合作用和糖类代谢等有关[48]。

Marianna等[49]使用Combimatrix微阵列芯片技术比较了霜霉菌侵染后的美洲种河岸葡萄（V. ripara）与欧洲葡萄（V. vinifera）初期转录本变化，挖掘出的一些候选抗性基因涉及病程相关蛋白、苯丙烷类化合物、信号转导级联组分和茉莉酸等。Malacarne等[50]进行了葡萄种群的代谢和转录分析，发现抗病葡萄中积累反式-白藜芦醇、反式-白藜芦醇苷、反式-紫檀芪和多达13种不同葡萄素，以及参与特异转录防御反应、光合作用、初级和次级代谢、信号转导和运输等基因。上述葡萄与霜霉菌的互作均基于不同抗病葡萄与混合霜霉菌。Li等[51]分析两种葡萄霜霉菌分离菌与葡萄的互作，发现在非亲和互作中抗性相关基因、信号传导相关基因、激素相关基因、病程相关蛋白基因以及与防御相关代谢物合成相关基因，如苯丙烷类/芪类/类黄酮合成基因在感染早期表达更高。Xu等[52]通过蛋白质组分析表明，在霜霉菌侵染后抗病葡萄中通过下调表达光合相关蛋白和ATP合成酶来限制病原菌生长，而上调表达PR10蛋白来限制葡萄霜霉菌侵染范围。Nascimento-Gavioli等[53]研究表明，含有Rpv1和Rpv3基因位点的葡萄对霜霉菌的抗性反应主要涉及氧化还原和能量代谢，尤其是L-抗坏血酸降解途径。Ma等[54]研究表明，葡萄霜霉菌入侵葡萄叶片后，VpPR10.1与VvVDAC3蛋白相互作用，增大线粒体膜孔通道，细胞色素C释放到胞质中，激活Metacaspase基因表达，诱导病原菌入侵部位细胞死亡，抑制病原菌生长，阻止葡萄霜霉菌的进一步侵染。

3 葡萄霜霉菌效应因子致病机理

细菌、真菌或卵菌等病原菌对植物的侵染依赖于一种称为效应因子的致病性因子，这种效应因子能分泌效应蛋白改变宿主的新陈代谢，以达到成功侵染寄主的目的[55]。因此，研究葡萄霜霉菌效应因子致病机理，探究葡萄-病原卵菌互作的分子机制对抗病育种具有重要的意义。科学家们通过转录组和全基因组测序手段获得了大量的候选效应因子，但大多数的效应因子作用机制尚不清楚，尤其对葡萄霜霉菌效应蛋白的研究还处于起步阶段。葡萄霜霉菌效应蛋白主要包括两类：一类是具有RxLR基序的效应因子，另一类是类似于RxLR的Crinkler（Crinkling and necrosis protein，CRN）效应因子。

3.1 葡萄霜霉菌RxLR类效应因子

RxLR类效应因子是根据位于效应蛋白的N-末端区域保守的RxLR（Arg-X-Leu-Arg）序列以及其下游5～25个氨基酸的dEER（Glu- Glu-Arg）基序命名[56-57]。RxLR基序可能负责将效应蛋白从卵菌和真菌转移到寄主细胞内[58-59]。

近几年，有关葡萄霜霉菌RxLR类效应因子的研究进展迅速。Mestre等[60]首次通过葡萄霜霉菌萌发的游动孢子构建了表达序列标签（EST）文库，并从中筛选出26个特异表达的分泌蛋白，其中有2个RxLR-dEER效应蛋白，通过半定量PCR分析发现在侵染早期有高表达。Yin等[61]对“ZJ-1-1”“JL-7-2”和“CSRIO-L-2”三个葡萄霜霉菌小种的转录组数据分析，发现了3万多个霜霉菌基因受到诱导表达，进一步鉴定了51个RxLR类效应蛋白，并且发现这些效应蛋白均能抑制由BAX和INF1引起的细胞死亡。随后，Mestre等[62]又通过平行转录组测序法挖掘到50个RxLR类效应蛋白。Xiang等[63]对克隆到的23个RxLR效应因子进行本氏烟草瞬时表达发现，只有PvRxLR16可以引起烟草叶片细胞死亡，17个可以完全抑制不同激发子诱导的烟草叶片细胞死亡，5个部分抑制细胞死亡，表明葡萄霜霉菌能够通过分泌RxLR效应因子进而抑制PTI、ETI和其他类型的免疫反应。进一步研究发现，PvRxLR16存在W/Y/L基序和一个预测的N-糖基化位点，点突变糖基化位点后不能引起细胞坏死，病毒诱导的基因沉默发现PvRxLR16功能依赖于SGT1、Hsp90和RAR1介导的信号转导，而不是Serk3/Bak1[64]。意大利的Brilli等[65]通过全基因组测序，从“PvitFEM01”葡萄霜霉菌数据库中鉴定了58个候选RxLR效应因子，其中一个编号为PVITv1008311效应因子能够引起河岸葡萄叶片的HR反应，而在欧亚种葡萄中未出现防卫反应引起的细胞坏死。Lan等[66]的研究发现，葡萄霜霉菌效应因子PvRxLR131通过靶向植物受体样激酶抑制剂BKI1抑制植物免疫以促进病原菌侵染，在本氏烟草中沉默NBBKI1，PvRxLR131的毒性丧失，说明PvRxLR131效应因子的活性是由BKI1介导的；PvRxLR131-转基因植株表现出BKI1过表达的的矮化表型，抑制了油菜素内酯（BR）和ER（ERECTA）信号转导。

3.2 葡萄霜霉菌CRN效应因子

CRN蛋白家族最初在致病疫霉中被鉴定，并根据其分泌蛋白在植物中异位表达所呈现的特征性叶片皱缩而命名。CRN效应蛋白在植物致病卵菌和共生真菌中普遍存在，是胞内效应因子的第二大类效应蛋白[67]。与RxLR蛋白类似，CRN蛋白家族中的成员也是模块分子，包含信号肽，保守的N末端氨基酸基序：LXLFLAK，其后是保守的DWL结构域和HVLVVVP基序以及高度多样化的C末端区域，并且可能通过N-和C-末端区域的重组而发生变异[68-69]。

目前，关于葡萄霜霉菌CRN效应因子的报道较少。2016年，Mestre等通过葡萄霜霉菌转录组数据库外挖掘到60个CRN效应蛋白[62]。Brilli等[65]从葡萄霜霉菌“PvitFEM01”的全基因组测序结果中挖掘到58个CRN效应蛋白，qRT-PCR结果显示其受葡萄霜霉菌诱导表达。到目前为止，关于葡萄霜霉菌CRN效应因子的功能等研究还未见报道。

4 分子标记辅助抗霜霉病育种

长久以来，培育优质高抗的新品种一直是葡萄育种工作者的研究目标。利用分子标记辅助选择的分子标记辅助育种技术是葡萄抗病分子育种的重要手段，其目的是将不同的抗性位点结合起来，以获得持久的抗性。利用分子标记对抗性基因进行标记，并了解其功能，是培育持久抗性品种的关键[70]。

葡萄霜霉菌属于微效多基因控制的数量性状[71]，中国野生种葡萄存在抗葡萄霜霉病的主效基因[72]，利用高抗的中国野生种葡萄与优质的欧洲种葡萄杂交而培育抗霜霉病品种是育种工作的重要研究任务。近十几年来，分子标记辅助育种取得了很大的进展。罗素兰等[73]利用Wizard DNA Clean-up System纯化回收抗葡萄霜霉病主效基因连锁的随机扩增多态性DNA（RAPD）标记OPO 06-1500，并进行序列分析，为抗病杂种早期鉴定、DNA探针合成及获得抗霜霉病基因提供依据。简单重复序列（SSR）标记因其可靠性高、稳定性好、成本低等特点，在遗传定位、种质鉴定、标记辅助选择等领域得到了广泛应用，是理想的分子遗传标记。随着基因组测序的快速发展，广泛分布在葡萄基因组中的高度多态性SSR分子标记已被应用到种质资源遗传连锁分析和数量性状位点（QTL）定位[74-75]。葡萄霜霉菌的数量性状位点已经被鉴定，并且获得了抗葡萄霜霉病性状的基于种群分离的分子图谱，并将这些抗霜霉病的QTLs命名为Rpv（Resistance toP. viticola）。到目前为止，已经在4、5、6、7、8、9、11、12、14、17和18号染色体上鉴定出27个位点（Rpv1-Rpv27），它们在不同的遗传背景下赋予对葡萄霜霉病的抗性[76-79]。基于此，Zhao等[80]选择30个SSRs和抗性基因类似物（RGAS）标记，对120个葡萄野生种质资源的霜霉病抗性进行了定量分析，获得一批对葡萄霜霉菌高抗的野生葡萄株系（如云南元谋-2、云南-2、木札岭-3等）。

5 展望

综上所述，葡萄抗霜霉病属于多基因控制，有多种组分参与抗病性，野生抗病葡萄种质资源抗病作用机制还不清楚，目前利用抗病种质通过常规杂交育种仍然是培育抗病品种的主要途径。随着高通量测序技术的发展，越来越多的葡萄和病原菌特征基因组被揭示，更多的抗性基因被发掘和应用在遗传育种中。一方面，挖掘NBS-LRR抗病基因通过转基因或过表达基因显著提高了植物的抗病性。目前，葡萄中少数NBS-LRR基因已被克隆，然而缺少深入研究。葡萄NBS-LRR蛋白不同结构域与病原菌的效应蛋白是如何相互作用的？在亲和与非亲和互作中NBS-LRR蛋白起作用的差异是什么？这些问题的解决对葡萄NBS-LRR基因的利用具有重要的意义。另一方面，小RNA在葡萄抗病中发挥重要作用，通过对小RNA的调控可以实现葡萄抗病性的提高，不同葡萄的病原真菌诱导的相同小RNA的表达不同，这可能与葡萄的遗传、生长阶段以及R基因的存在与否有关。因此，通过反向遗传学方法对单个小RNA及其靶基因在抗病遗传育种中的有效应用将成为今后研究的重点。最后，感病基因（S）突变能提高果树抗病性而成为果树遗传育种的目标。S基因突变在培育广谱而持久抗性品种中具有很好的应用前景。S基因是病原菌-寄主间亲和互作的决定因子，在遗传育种中具有巨大的应用价值，随着基因组编辑技术和转基因技术的发展，S基因应用的前景必将越来越广阔。