食品微生物污染检测方法综述

□ 阮雁春 江苏旅游职业学院

1 前言

食品安全与卫生问题是当前食品领域关注的重点，其中包括新的食源性致病菌株、掺假食品、长期食用转基因食品、食品中存在的化学污染物和食品腐败等，而微生物污染是导致诸多食品安全问题的主要因素。快速精准的食品微生物检测技术对于保障安全的食物供应和减少食源性疾病的发生率是十分重要的。常规方法来检测食品中微生物比较耗时，且不能分析新的物种，因此许多食品分析需要采用快速检测方法。快速检测方法可分为：核酸序列技术、生物传感器技术、免疫学方法。这些快速检测方法具有特异性强、灵敏性高、高效性与耗时少等特点，与传统检测方法相比，具有很大的优势。本文就微生物检测方式在食品中的应用情况以及其各自所具备的特点进行综述。

2 生物检测技术

2.1 依靠培养的微生物学方法

依赖于生物培养的方法需要长时间的收集样品，在选择性或合适的培养基上获得可见的微生物菌落。大多数食源性和水源性病原体的潜伏期为18～24 h，微生物菌株不同潜伏时间也不同，最长可达72 h。该方法只能计数那些可在一定培养温度、培养时间、选择性培养基和氧气条件下生长的微生物。生物发光是利用特定酶（如荧光素酶）在酶促反应期间的发光能力，检测微生物的常见方法，可用于检测确定的细胞及其生理状态。生物发光还可以用来测量活细胞中三磷酸腺苷（ATP）的产生，其可用作荧光素酶反应中的底物。噬菌体分型专门用于检测单个细菌菌株并用于追踪感染源，该方法在很长一段时间内被用作检测和鉴定生物的工具。但是，当前只有少数基于噬菌体的方法从中试规模实验转变为临床诊断实验。研究表明，该方法对于肠道沙门氏菌和大肠杆菌的检测具有高度特异性[1]。

2.2 基于核酸序列的检测技术

基于免疫学和核酸序列的检测技术被认为是微生物学中最有效的技术。基于核酸序列的方法如PCR技术，可以检测微生物及其毒素，但免疫方法对于微生物的检测并不依赖于其是否含有蛋白质。这些技术包括：整合基因分析、多重PCR技术、变性梯度凝胶电泳技术（或PCR—DGGE）与长度异质性聚合酶链反应（LH—PCR）。此外，还有数字实时聚合酶链反应技术（RT—PCR）等[2]。遗传指纹技术基于PCR扩增，与PCR克隆和测序方法相比，此技术更容易实现且耗时更短。指纹技术的基础是通过在运行凝胶（琼脂糖或聚丙烯酰胺）上的电泳迁移差异确定扩增的遗传序列的多样性。

3 生物传感器

生物传感器是一种化学传感装置，其能够将任何生物、生物衍生材料、仿生材料与物理化学检测器或换能器结合。生物传感器根据其转导方案不同，可以分为不同类型，并应用于不同领域（如临床和食品检测、生物防御、水安全和环境监测等）[3]。据最新资料显示，由于微生物污染和腐败所造成的食物浪费占全球食品总消费量的1/3以上[4]。高效快速的生物传感检测技术，可以从源头检测控制食品中微生物情况，有效减少整个食物损失。

3.1 电化学生物传感器

这种生物传感器主要是通过检测样品与传感器在基质界面上的相互作用所导致的电流、电势等参数的变化情况，进而得到分析结果。在各种类型的生物传感器系统中，电流分析法是最常用和最常用的电化学方法。相对而言，电位分析法不太常见，其通常由生物活性物质和离子选择性膜组成，在反应过程中产生极小的浓度变化。基于碳纳米管和石墨烯的电位生物传感器，可快速和超灵敏检测真实体系样品中的微生物。结合了微加工和纳米加工的阻抗法，是较为新型的生物传感器，并被寄予厚望[5]。

3.2 光学传感器

光学传感器具有高选择性和高灵敏度的特点，可快速检测病原菌、各种毒素和污染物。目前，生物传感器已纳入纳米生物技术，在临床和即时检测（POC）中发挥关键作用。另一个应用是纳米孔技术，光学生物传感器和微流体技术的组合，当与特定细菌抗体比对时，它们可以基于纳米孔阵列上的阻断效应检测单个细菌细胞，导致孔隙可用性降低。等离子体生物传感器是最具吸引力的光学生物传感器，主要的等离子体生物传感器系统使用的是表面等离子共振（SPR）和表面增强拉曼光谱（SERS），但前一种技术的灵敏度相对较低。

4 生物化学检测技术

4.1 生化表征

当前较为常见的检测微生物方法有各类常规观察法以及生物化学方法。比如形态学检查，微生物菌落能够向经验丰富的微生物学家提供鉴定线索。根据细胞壁构造和组成差异，微生物可分为革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌；其他化学特性也在细菌鉴定中起重要作用，例如糖发酵、酶和抗生素抗性，这些都可以很容易检测。有几种生化测试可以帮助细菌鉴定，例如，表征纤维素酶活性、过氧化氢酶活性、反硝化试验、硫化氢的产生和细菌样品的碳源利用情况等。如今，更便捷强大的基于核酸序列的技术等较上述方法，更加有优势。

4.2 免疫学检测技术

免疫学方法是基于抗体和抗原的特异性结合的原理进行检测，食品研究中广泛使用的免疫学方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、酶联荧光试验（ELFA）以及免疫磁分离（IMS），其中酶联免疫吸附试验是利用抗原抗体的特异性反应结合颜色变化进行鉴定，是最通用的免疫测定方法，当前已有市售的ELISA试剂盒[6]。酶联荧光试验也是一种基于免疫学的方法，但更灵敏。免疫磁分离是一种实验室工具，可以有效地从各种体液和原代培养细胞中分离细胞，它可以用来量化食物、血液或者粪便等样本的致病性。

5 微生物仪器检测技术

微生物检测仪器的发展，可以实现复杂样本的及时检测和评估。在二十世纪九十年代以前，人们常通过计数和生化分析进行常规检测，而显微镜、流式细胞术、光学方法、生物发光、超声波和量热法在二十世纪九十年代开始用于检测，另有物理化学方法也可以用于检测微生物。例如，用于脂肪酸分析和微生物检测的气相色谱法，当前仍用于检测各种微生物化合物，基于红外光谱的其他仪器技术也普遍被应用在该领域。

5.1 流式细胞仪

流式细胞仪是生物领域一种十分主要的检测工具，也是传统激光技术的改进技术。它由几个主要部件：激光器、样品室和装有光电倍增管的光电探测器系统组成。由于其简单快速的性能，流式细胞仪常被用作临床检测中的杀菌活性检测。研究表明，流式细胞仪可以在食品工业中检测微生物的污染情况，提供关于微生物生理状态的详细知识，同时通过使用特异性探针和荧光染料，可以在混合培养物中快速计数。

5.2 气相色谱和质谱

其在分析化学中常见的应用是分析挥发性化合物，通常用于纯度测试以及鉴定混合物中的物质。此外，还可以通过色谱分离纯物质。该技术近年来被发现可用于鉴定微生物。气相色谱—质谱（GC—MS）是鉴定和检测细菌及其化合物的有效工具。新的小型化技术如GC—DMS（气相色谱—差示迁移谱）已用于检测大肠杆菌等，同时通过GC—MS进一步确认结果。这两种技术都可以用于检测细菌细胞释放的各种化合物（如O—硝基苯酚和吲哚）。基质辅助激光解吸电离—飞行时间（MALDI—TOF）质谱，提供了特定的生物标志物配置文件，可以实现快速检测，高效且成本较低。MALDI—TOF MS已被用于快速检测高致病性细菌，包括芽孢杆菌、耶尔森氏菌、伯克霍尔德氏菌、弗朗西斯菌和布鲁氏菌等[7]。

6 光谱技术

光谱学涵盖了物质和电磁辐射之间的所有相互作用。红外光谱是微生物识别系统中最广泛的一种方法。它分为近红外（NIR）、中红外（MIR）和远红外（FIR）光谱3个主要区域，并且具有比可见光谱更长的波长。该技术通常应用于有机和无机分析化学中，以确定分子的各种官能团。最具发展潜力的光谱技术包括傅里叶变换红外光谱（FTIR）、拉曼光谱和高光谱成像，其已被用于快速检测微生物污染[8]。

7 展望

致病微生物在食品中的危害是当前食品领域的一个重要挑战，也是造成经济损失的主要祸首。本着“预防胜于治疗”的原则，实现食品中致病和致腐微生物的快速高效检测，是降低微生物危害的有效手段，因此，当前迫切需要开发智能、快速和可靠的微生物检测方法，尤其是在线检测方法。随着技术不断的发展进步，很多限制因素会慢慢得到解决。