神经干细胞移植治疗缺血性脑卒中研究进展

张敏娜，张一兵综述，王光辉，钟 鸣审校

脑血管疾病是全球面临的首要健康问题，缺血性脑卒(ischemic stroke)中发病率、致残率和死亡率一直居高不下。缺血性脑卒的核心病变是致血管内部空间变窄时甚至封闭血管，缺氧缺糖 (oxygen-glucose deprivation，OGD)引发炎性损伤、组织坏死和细胞凋亡的发生[1]。溶栓/切除血栓的临床治疗策略由于治疗时间窗狭窄难以达到满意的治疗效果，因此开发缺血性脑卒中精准治疗新策略势在必行。近年来研究发现神经干细胞(neural stem cells，NSCs)及骨髓间充质干细胞(bone marrow stem cells,BMCs)等通过增殖分化和迁移、改善受损区细胞生存微环境、重建受损区域神经元网络、最大限度的恢复缺失的神经功能[2,3]。近年来干细胞移植治疗脑血管疾病的研究主要集中在神经干细胞联合移植、干细胞纳米材料传递体构建、移植后实时监测细胞增殖、微小RNA(miroRNA)对神经干细胞的调控和基因修饰后移植神经干细胞等方面， NSCs移植治疗缺血性脑卒中的作用和机制为临床精准治疗提供有益参考。

1 移植NSCs对缺血性脑卒中治疗作用与意义

脑卒中动物模型常用大鼠大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)及缺血再灌注(ischemia-reperfusion injury,I/R)模型，体外扩增和移植的方式引入外源性NSCs、BMCs等具有增殖分化能力的干细胞，也可以激活脑室管膜室下区SVA和海马齿状回颗粒层下区SGZ的成体干细胞aNSCs(SVA和SGZ为aNSCs较为集中部位)[4,5]，NSCs以及其神经前体细胞(部分源于BMCs)的诱导激活增殖分化和迁移重构神经元网络为修复受损脑区带来了新的治疗前景[6,7]。通过NSCs自我更新、多向分化能力，内分泌、抗炎、抗损伤等作用，有利于损失的神经元网络的重新构建，具体治疗作用包括组织修复(诱导分化形成神经元、少突胶质细胞等)、神经突触重构(诱导βIII神经微丝蛋白的表达和延伸)、神经内分泌(神经营养因子)、激活损伤区域附近存在的NSCs和神经前体细胞、诱导微血管发生、自噬功能调节、外泌体的形成与调控、维持细胞增殖内环境的稳定等[8,9]。

2 NSCs移植治疗缺血性脑卒中研究

2.1 联合移植治疗 尽管成人神经干细胞原位激活参与修复发挥到一定作用，但是距离理想的修复还有一段很长的研究之路要走，不同类型的干细胞，如NSCs、BMCs、PC12细胞、胚胎干细胞、牙髓干细胞、以及人诱导多能干细胞(hi-PSC)等衍生的神经干细胞/神经祖细胞作为缺血性卒中的治疗的良好储备细胞[10,11]。传统NSCs移植的主要方式包括局部注射、动脉或静脉注射、脑室脑脊液注射等途径，各有利弊，近年来NSCs移植方式/方法也在不断的改进和更新，突破了单一种类细胞移植的局限，尤其是移植方式的改变如联合特定的条件移植、联合特殊的细胞移植、联合药物等移植为移植后细胞成活创造了良好的条件。胚胎源性NSCs+脑血管内皮细胞共培育后同时移植，借助内皮细胞的分泌作用和周细胞(pericyte)成血管作用发挥抑制炎症反应、突触重塑、调节细胞自噬功能[12]。NSCs联合亚低温疗法(33 ℃)，借助于低温条件减少细胞代谢、增加对缺血缺氧损伤的耐受能力，结果显示缺血后梗死面积减小伴有炎性损伤明显减轻[13]。突破血脑屏障是血液途径移植干细胞到达脑区研究方向，甘露醇联合替莫唑胺(Temozolomide)可以改变脑血液渗透压的同时，增加血脑屏障的通透性，所以NSCs+甘露醇+替莫唑胺静脉注射到慢性脑卒中动物模型后明显增加NSCs脑内递送[14]。综合上述研究，与单纯NSCs移植相比，增加病变周围区域的溴脱氧尿苷(活跃增殖细胞聚集区域)、双皮质素(新生神经元所在区域)和Reca-1阳性细胞(血管内皮细胞)的表达，联合治疗更有助于改善行为缺陷，其机制可能涉及增加进入脑缺血区干细胞的数量、改善神经再生和血管生成。

2.2 纳米材料作为移植传递体的治疗 纳米颗粒粒径小(1～100 nm)，表面体积/体积比相对大，有利于细胞或分子(药物、抗体)附着，纳米技术提高药物生物利用度，增加药物的特异性治疗作用，降低了药物的不良反应[15]。纳米材料作为NSCs移植的传递体，为提高移植后细胞生存率和改善神经功能方面作用突出，磁性纳米材料的导入可以在治疗中进行实时监测效果，成为细胞移植治疗的新亮点。

中枢神经系统细胞不良再生能力干细胞在脑损伤中的治疗效果，尤其持续的炎症反应、缺乏结构支持和营养因子缺乏等因素抑制了细胞的整合和长期存活。硫酸化糖胺聚糖基聚电解质复合纳米颗粒的纳米杂化水凝胶可以模拟脑细胞外基质，并控制基质衍生因子SDF-1α和bFGF的递送。bFGF对基质金属蛋白酶的反应，用于募集内源性NSCs和调节其细胞增殖和发育。利用PCN表面静电隔离技术释放生物活性因子，体外扩增SDF-1α和bFGF信号转导以调节NSCs。在体内缺血性卒中模型中，这些因素通过增强神经发生和血管生成来促进神经行为恢复[16]。缺血性脑卒中治疗最关键的是恢复神经回路，其中神经元功能重建起着中心作用。损伤微环境中由于髓鞘相关抑制因子结合Nogo-66受体(NgR)导致NSCs向神经元分化不良，严重影响了治疗效果。将钴超顺磁性氧化铁纳米粒子和靶向NgR基因的siRNA编码入NSCs的纳米聚合物，通过沉默NgR基因来指导NSC的神经元分化，更有意义的是可以通过磁共振成像实时无创地监测NSCs的迁移状况，集治疗与实时监测于一体。结果显示体外实验结果NSCs分化为神经元的比例可由3%左右提高到37%左右；体内实验显示将经过钴超顺磁性氧化铁纳米粒子和靶向NgR基因的siRNA编码入NSCs处理过的神经干细胞直接移植到脑梗死动物模型，神经元的比例也可由4%左右(对照组)提高到27%左右(钴超顺磁性氧化铁纳米粒子组)，缺血性脑卒中大鼠的神经功能恢复得到改善[17]。

2.3 基因修饰治疗 基因修饰处理后的神经干细胞具有了更强的增殖分化能力和促进血管增生改善微环境作用，缺氧诱导因子(Hypoxia-inducible factor,HIF)、GDNF、NT-3和bFGF等基因修饰的NSCs移植治疗研究取得很大进步。HIF在缺氧环境中参与基因转录，HIF-1由HIF-1α(120 kD)和HIF-1β(91～94 kD)两个亚单位组成的异源二聚体。经重组腺病毒构建AD-HIF-1α载体,感染NSCs后经脑室内移植进入MCAO动物。4 w后HIF-1α的免疫印迹和免疫组化结果均显示Nestin阳性移植细胞以及神经元(NSE阳性)和星形胶质细胞(GFAP阳性)数量明显增加。行为学检测结果标明动物运动功能和认知功能改善明显。缺血区Ⅷ因子阳性细胞(血管内皮细胞)数增加，表明HIF-1α的表达同时促进血管生成[18]。

GDNF促进轴突再生。GDNF/NSCs更能显著抑制脑炎症、提高髓鞘密度的。GDNF/NSCs的存活率明显高于移植的NSCs。移植的GDNF/NSCs分化成更多的神经元和少突胶质细胞。此外，在大鼠GDNF/神经少突胶质细胞mRNA的表达与大鼠神经干细胞显著增加[19]。联合移植和基因修饰GDNF基因修饰胎鼠中脑外侧区中脑来源神经干细胞mNSC，培养5 d。与PBS注射和GFP基因修饰的mNSCs移植相比，GDNF基因修饰中脑来源的是神经干细胞mNSCs移植后56 d，大鼠脑内移植细胞数量增多，移植组检测到更多分化的多巴胺能神经元[20]。改善中脑损伤引发的退行性改变分子机制尚需进一步阐明。NT-3基因修饰的NSCs联合胶原蛋白硫酸肝素支架移植可显著改善脑出血大鼠运动功能。移植的神经干细胞具有较好的存活、迁移和分化能力[21]。MCAO大鼠腹腔注射改良bFGF基因修饰的C17.2NSCs(5×106/200 μl)于MCAO后第7天和第28天进行组织学分析。C172细胞在脑内的存活、迁移、增殖和分化均得到改善[22]。

3 microRNA在NSCs修复缺血性脑卒中治疗中的调控作用

microRNA为1993年发现的一类小分子非编码RNA(21～25个核苷酸),通过断裂靶标mRNA和抑制翻译过程参与基因表达的调控，转录过程中与基因的非编码区的结合在转录后水平上抑制基因的表达,另外microRNA为一种作为表观遗传因子，参与胚胎发育过程的时间和空间顺序的生物钟调节、细胞调亡、各类型干细胞增殖分裂和分化，神经生物学研究发现miroRNA在中枢神经系统高度富集，参与神经元分化和突触形成过程[23,24]。与NSCs及BMCs分化为神经细胞相关的有miR134、miR145、miR124和miR126在神经干细胞移植治疗MACO中的调控作用也是研究热点问题。Chi等[25]发现MACO经缺氧缺糖处理后，BMCs miR134水平下降，而incaspase-8水平升高，通过降低caspase-8的表达和活性而显著抑制细胞凋亡。进一步研究发现表达caspase-8小干扰RNA敲除caspase-8可减少少突胶质细胞凋亡，实验结果表明，源于骨髓间充质干细胞的神经前体细胞外体通过负性调节caspase-8依赖的凋亡途径，miR134抑制少突胶质细胞的凋亡。定量逆转录酶实时聚合酶链反应检测miR145相关mRNA通路，发现miR145、细胞外信号调节激酶(ERK)和p38 mRNA在大鼠NSCs中的表达呈时间依赖性。Western blot显示miR145的过度表达促进了NSCs中MAPK通路相关mRNA和蛋白的表达，而miR145的表达抑制了MAPK通路的表达。miR145在NSCs中的过度表达促进了细胞周期素D1、巢蛋白、神经元特异性烯醇化酶和胶质纤维酸性蛋白蛋白的上调，增强了NSCs的活性，促进了细胞增殖和分化，抑制了细胞凋亡和裂解caspase-3的表达。移植后大鼠NSCs过度表达miR145后，行走能力和神经功能恢复迅速，皮质中产生更多神经元。miR145通过靶向MAPK通路保护脑缺血大鼠神经干细胞的功能[26]。miR 124纳米颗粒(NPs)在缺氧缺糖后降低了细胞死亡并改善了室下区神经干细胞培养的神经元分化，进一步深入研究，换用血栓形成诱导的永久性局灶性脑缺血后立即静脉注射miR 124纳米颗粒在PT后14 d,免疫学发现SVZ中5-溴-2’-脱氧尿苷(BrdU)和双皮质素/BrdU阳性细胞的数量变化不明显，即SVZ中神经干细胞/神经祖细胞增殖未见影响。但是miR124NPS能够在卒中后第2天特异性地增加IL-6水平，起到明显改善炎性微环境的作用[27]。相似的研究还发现脊髓损伤后miR126在促进神经干细胞生长增殖的同时,通过负向调节HOXA9表达提高神经干细胞向神经元的分化,从而促进小鼠运动功能修复[28]。血管内皮细胞的生成和调节也是一个神经组织修复的关键环节，表达miR126的内皮前体细胞(endothelial progenitor cell，EPCs)被注入脑卒中小鼠，微血管密度增加，神经功能评分和梗死体积减少，进一步研究显示miR126通过MIR 126/SDF 1/CXCR7信号通路促进EPCs的迁移[29]。

4 思考与展望

成年内源性神经干细胞的作用可能是以内分泌功能调控神经系统内环境为主，增殖分化功能相对较弱，激活信号通路机制方面有待于进一步深入研究。相比之下外源性神经干细胞移植治疗前景广阔，尽管目前存在伦理的问题、免疫排斥反应甚至诱发脑部肿瘤的风险等[30]，随着神经干细胞生存环境的逐渐改善，特别是近年来基因组学的研究深入，包括microRNA的调控作用研究、NSCs基因修饰研究和基因编辑技术精确调控基因表达研究等，加之纳米技术磁共振成像的应用实现了对NSCs移植位置及分布实时监控和生长发育动态的追踪，为NSCs精准治疗缺血性脑卒中创造了有利的条件。