血脑屏障在缺血性卒中病程中的破坏与保护策略

陆正齐

（中山大学附属第三医院神经内科，广东广州510630）

血脑屏障（blood-brain barrier，BBB）的核心成分是内皮细胞（endothelial cell，EC）［1］，近年来提出“神经血管单位”（neurovascular unit，NVU）的概念，它还包括为BBB提供了结构和功能支持的星形胶质细胞（astrocyte，Ast）、周细胞（pericyte，PC）和细胞外基质，神经元、小胶质细胞也参与其中［2］。在正常生理条件下，BBB起着“屏障”的作用，相邻EC及细胞之间紧密连接（tight junction，TJ）使大多数分子不能自由地通过BBB。对完整性起重要作用的紧密连接蛋白（tight junction proteins，TJP）主要包括跨膜蛋白Occludin和Claudins。Occludin通过与胞膜内的闭锁蛋白家族（zonulaoccludens family，ZO）与细胞骨架相连。而胞外的连接粘附分子（junction adhesion molecules，JAM）也参与调节TJP的功能［3］。TJP和JAM各自形成蛋白质复合体通过ZO锚定在由肌动蛋白组成的细胞骨架上。这些结构将内皮细胞连接得更为紧密，使得外周的分子更难通过BBB。除了内皮细胞，其他组分如Ast、PC也为BBB的完整性提供重要作用。缺血性卒中（ischemic stroke，IS）后，糖氧剥夺及随后的再灌注损伤都迅速地使局部发生明显的能量障碍以及产生大量氧化应激产物［4］。BBB各组分以及因BBB受损而聚集于脑损伤部位的炎症细胞在此环境下持续激活，通过不同的方式破坏或维持BBB的完整性。本文将通过阐述IS后脑缺血局部聚集的不同细胞的表现来展现IS后BBB的损伤，并综述相应的治疗策略。

1 缺血性卒中过程中BBB的破坏

1.1 内皮细胞

缺血性卒中再灌注发生后，ATP产生不足导致的能量缺乏以及大量的氧化应激产物活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）作为BBB的基础组成细胞的血管内皮细胞内的肌动蛋白（actin）发生聚合、肌球蛋白轻链（myosin light chains，MLC）磷酸化，随后导致肌动蛋白-MLC收缩和细胞骨架张力增加，细胞形态结构受损，最终使得细胞间的紧密连接结构受损，BBB渗透性增加［5］。其中Rho激酶（Rho kinase，ROCK）/MLC通路是引起肌球蛋白-肌动蛋白收缩的关键信号通路［6］。除了ROS能促进该通路的激活，随着BBB破坏，入侵的外周炎症细胞以及中枢神经系统激活的细胞所分泌的炎性因子也可以持续地激活此通路，从而使得早期BBB破坏不断加重［6-7］。此外，Caveolin-1（Cav-1）已被确定为一种参与内吞作用，囊泡运输和信号转导的重要调节因子，研究证明糖氧剥夺（oxygen glucose deprivation，OGD）条件下可激活Cav-1，从而使得本应在细胞间分布的Claudin-5重新分布，导致早期缺血性BBB破坏。另一方面，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteases，MMP）是卒中后导致紧密连接以及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）降解的强力因子，内皮细胞在ROS以及炎症因子的刺激下是卒中持续进展中MMP的重要来源，从而导致BBB在MMP依赖性的途径中不断被破坏。

由上述可见，内皮细胞间的紧密连接破坏得益于卒中发生后局部复杂的炎症环境，此时脑损伤部位包括小胶质细胞、Ast、PC等在内的细胞与外周入侵的细胞在局部在这种环境下迅速被激活，分泌各种神经营养因子、炎症因子、趋化因子等分泌蛋白诱发内皮细胞结构的改变，参与BBB的破坏与修复中［4］。

1.2 小胶质细胞/巨噬细胞

小胶质细胞是中枢神经系统中含量最丰富的免疫细胞［8］。虽然在生理条件下小胶质细胞几乎是静息的，但在缺血性卒中发生后，小胶质细胞是梗死区域首先被激活的免疫细胞［9］。在卒中发生的早期，小胶质细胞主要对细胞碎片进行吞噬作用，表现出抗炎的作用。然而，当早期BBB部分开放后外周血中的纤维蛋白以及白蛋白等血清蛋白渗透至脑损伤部位后，附近的小胶质细胞将被吸引至损伤部位的血管聚集，通过吞噬血管内皮细胞使得BBB完整性进一步受损。与此同时，激活的小胶质细胞在损伤部位增强ROS（NADPH氧化酶），细胞因子，如：白细胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6和肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和趋化因子（MCP-1）的释放［9-10］。如前所述，ROS的增加使得内皮细胞的细胞骨架结构受损，而细胞因子的释放则可直接导致内皮细胞间的紧密连接蛋白如Claudin-5及Occludin降解，IL-6还可以通过激活NF-κB使得内皮细胞黏附分子，如：细胞间黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）、血管细胞粘附分子（vascular cell adhesion molecule，VCAM）等表达上升，增强外周白细胞通过BBB向损伤部伤入侵的能力［10］。此外，小胶质细胞还是卒中发生后MMP主要来源之一，病理检查已发现卒中患者大量MMP-9与小胶质细胞的共定位证据［11］。

值得注意的是，近年来的研究［12-13］已经明确在缺血性卒中后小胶质细胞以及入侵的巨噬细胞存在M1与M2两种功能相抵的亚型（这里必须注意小胶质细胞存在多种激活状态，实际上并不能简单笼统地分为两型）。总的来说，M1型小胶质细胞/巨噬细胞主要表现为致炎作用，通过分泌上述蛋白因子破坏BBB，而M2型小胶质细胞/巨噬细胞则主要表现为抗炎作用，主要表达IL-10和转化生长因子-β（transforming growth factor β，TGF-β）等抗炎因子，并主要执行清除细胞碎片、促进梗死区中半暗带的血管生成以及诱导效应性T细胞免疫应答无反应性。有研究［14］表明将小胶质细胞/巨噬细胞的表型极化至M2样表型而非无差别地抑制它们，可能对缺血性卒中的预后更有利。

1.3 星形胶质细胞

星形胶质细胞是中枢神经系统中最丰富的胶质细胞。星形胶质细胞的终足包被99%以上的神经系统毛细血管壁，能促进内皮细胞的增殖分化，间接促进TJ的合成，并与周细胞协同维护BBB的完整性。将星形胶质细胞与血管内皮细胞共培养，后者的缝隙连接减少，紧密连接增多［2，15］。我们及其他实验室发现在脑组织缺血缺氧后，星形胶质细胞活化，体积变大，突起增多，胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）等多种蛋白表达增多，终足与内皮细胞所形成的毛细血管壁分离，从物理形态上增加BBB的通透性［16-17］。虽然小胶质细胞是中枢神经系统在缺血性卒中后炎性因子的主要来源，活化的星形胶质细胞也可以分泌也会分泌 MMP、IFN-γ、IL-1β、TNF-α和IL-6等促炎因子［18］，在帮助脑损伤部位其他细胞持续激活的同时也破坏着BBB的完整性。星形胶质细胞是缺血性卒中发生后早期血管内皮生长因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGF-A）的主要来源。研究［16，19］表明VEGF-A在缺氧条件或缺血性卒中后可引起内皮细胞间TPJ的破坏，从而导致BBB通透性升高。

我们的研究发现，早期利用抗IL-9中和抗体或是胰高血糖素样肽-1受体激动剂可使星形胶质细胞来源的VEGF-A生成减少，从而减少BBB的破坏［16］。然而，VEGF-A可促进新生血管的产生，调节卒中恢复期BBB的修复并促进局部胶质瘢痕形成［20］。另一方面，星形胶质细胞也是卒中后趋化因子如CXCL-1、单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1/CCL-2）的主要分泌细胞之一［21］。趋化因子主要通过吸引外周炎症细胞进入脑损伤部分从而间接地通过相应炎性因子的增加，如：CXCL-1-中性粒细胞-MMP，来破坏BBB，但是也有研究表明，MCP-1可诱导Cav-1激活使得紧密连接分子Claudin-5重新分布从而增加BBB的通透性，抑制CCL-2可直接保护BBB的完整性［22-23］。

1.4 周细胞

周细胞是一组位于内皮细胞、星形胶质细胞和神经元之间的可收缩的细胞，几乎完全嵌入BBB的基膜内。缺血性卒中发生后1 h周细胞便可从基膜分离并迁移，卒中后3 h，周细胞和基膜分离得更为明显，BBB的通透性也受此影响在增加［24］。与小胶质细胞及星形胶质细胞相似，在缺血缺氧环境下，周细胞胞内大量炎症细胞因子、趋化因子、细胞黏附分子的转录水平升高［25］，影响着BBB的通透性。但另一方面，早至缺血性卒中发生后2 h，周细胞与基膜分离的同时却可在梗死区域的血管周围发现大量的周细胞的快速聚集，这种聚集同时伴随着周细胞血小板源性生长因子-β（platelet-derived growth factor-β，PDGF-β）的表达上调［26］。PDGF-β可激活各种离子通道，根据代谢状态调节周细胞的收缩性，在灌注不足的情况下，扩张的周细胞从而改善灌注［26］。而这些在血管周围聚集的周细胞大多来源于骨髓周细胞祖细胞和相邻的未成熟的周细胞，可参与至卒中恢复期血管生成与BBB的修复进程中［27］。目前对于周细胞在缺血性卒中发生后对BBB的影响的研究仍十分有限，进一步的研究可能找到更多的靶点。

1.5 中性粒细胞

中性粒细胞是缺血性卒中发生后外周血中最先到达脑梗死区域的细胞，我们发现在脑中动脉缺血（middle cerebral artery occlusion，MCAO）模型小鼠梗死侧吸引中性粒细胞的趋化因子，包括：CXCL-1、-2、-3以及CCL-5的mRNA水平在卒中发生后迅速增加，在12 h便达高峰［28］，在趋化至梗死灶处时，中性粒细胞通过ICAM、VCAM、选择素（selectins）E、选择素L、整合素巨噬细胞-1抗原（macrophage-1 antigen，MAC-1）和淋巴细胞功能相关抗原（lymphocyte function-associated antigen 1，LFA-1）等黏附分子与内皮细胞粘附，并穿过至脑实质［29］。近年来对缺血性卒中患者死后的脑组织病理分析中［30］发现，中性粒细胞虽然入侵至梗死灶中，但更多的存在于血管周围，提示着中性粒细胞可能不是通过直接对脑实质的破坏而是通过影响BBB的屏障功能或NVU组成细胞的功能来影响缺血性卒中患者的预后。

中性粒细胞主要通过在跨大脑内皮细胞迁移过程中释放蛋白酶（如MMP，弹性蛋白酶，组织蛋白酶G和蛋白酶3等）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）产生的ROS来损伤BBB的基膜、紧密连接蛋白以及内皮细胞细胞骨架结构进行从而达到增加BBB通透性的作用［30］。目前的研究对于抑制缺血性卒中发生后中性粒细胞的负性作用主要通过减少相关趋化因子、黏附分子等表达来达到抑制中性粒细胞浸润脑损伤组织的目的。近年来研究发现，如小胶质细胞/巨噬细胞一样，中性粒细胞在缺血性卒中也可表现为N1及N2两型。我们的研究［28］发现，在OGD条件下中性粒细胞向N1型分化，并且表达过量的中性粒细胞胞外网捕陷阱（neutrophil extracellular traps，NET）。NET是由DNA、组蛋白及蛋白酶组成的网状结构，其作用主要为包绕入侵细菌等病原体，引发级联免疫反应，诱导炎症细胞至病灶，在加强神经元死亡的同时抑制巨噬细胞对其吞噬清除。而N2型细胞则相反，NET表达减少，在完成对缺氧环境的炎症反应后便被巨噬细胞吞噬，在此过程中对并不加剧对神经元的损伤，其表达的与BBB破坏相关的炎性因子也有所下降。目前我们仍不清楚中性粒细胞的分型对BBB的保护作用机制，但如小胶质细胞/巨噬细胞一样，诱导向N2型分化可能对BBB具有保护作用。

1.6 T淋巴细胞

免疫因素在卒中后的脑损伤中发挥重要作用。普遍的观点认为在缺血性卒中过程中T细胞对血脑屏障的作用更多是通过神经细胞间接发挥作用。Gelderblom等［31］发现早期进入脑梗死实质的CD4+T细胞通过分泌干扰素γ（interferon-γ，IFN-γ）刺激巨噬细胞分泌TNF-α并联合来源于γδ T细胞的IL-17刺激星形胶质细胞分泌大量的CXCL-1，从而增加中性粒细胞趋化至梗死区。我们的实验［16］也发现，来源于缺血性卒中后外周血表达比例升高的Th（T helper）9细胞的IL-9直接刺激星形胶质细胞可增加细胞分泌VEGF-A，从而加重BBB的破坏。

另一方面，Johnson等［32］发现CD8+T细胞可导致内皮细胞紧密连接蛋白的除解，随后导致BBB的通透性，虽然尚不清楚该作用依赖于神经元或是直接作用于内皮细胞，但该发现再次强调了适应性免疫反应在缺血性卒中可能有着不亚于固有免疫的重要地位。

2 缺血性卒中治疗中保护BBB的策略

上述可见，在缺血性卒中发生后的急性期内，或者说在中枢或是外周细胞募集于梗死区域最为活跃的3天内［13，16，24］，这些细胞主要表现为活跃的炎症激活状态。目前有关于改善缺血性卒中BBB的治疗大多依附于对整体脑损伤的治疗当中，如前所述，不少蛋白因子、ROS可由不同已激活的细胞分泌并且执行着破坏BBB在内的损伤脑组织的作用，因此必须明确目前在实验动物或是人类临床试验中应用的药物并非单独针对BBB保护的。

研究表明小胶质细胞/巨噬细胞、中性粒细胞具有可诱导的两极，向M2及N2型分化可能有利于卒中后各组分的修复［14］，但目前治疗方向仍以针对某类分子或是某种分子为主，如针对MMP、ROS、信号通路相关分子（如MAPK通路）、趋化受体等抑制剂类的药物在动物实验中可发现明确的作用，不但可减少BBB的通透性增加，还能明确改善动物的死亡率及预后［33-35］，但遗憾地是不少药物在动物模型上表现十分明确的药理机制却无法在临床试验上获得阳性结论，并且安全性不能得到保证。如中性粒细胞的大量入侵是致脑损伤处炎症反应早期迅速恶化的重要原因，针对介导中性粒细胞黏附的抗ICAM抗体治疗，虽然在大小鼠及兔的缺血性卒中模型中得到BBB通透性下降、梗死面积减少、提高神经功能评分等积极的结果［33，36］，但在一项临床试验中该抗体（恩莫单抗）治疗未能改善卒中的预后，反而增加了感染及出血转化的风险［37］；同样地，针对MAC-1分子的抗体治疗在大小鼠的动物模型中同样均得到了BBB通透性下降、梗死面积减少、提高神经功能评分等积极的结果［34，38］，然而，与恩莫单抗试验类似，临床试验中抗MAC-1抗体并未能改善卒中患者的临床症状与预后［39］。此外，有研究［40-41］称米诺环素是MMP-2、MMP-9的抑制剂，同时可减少小胶质细胞的分泌蛋白降低小胶质细胞中IL-1β和NO的分泌水平，这与MCAO模型中较小的梗塞面积相关。然而，在临床研究中关于米诺环素治疗卒中患者的结果却存在争议。有研究［42］指出米诺环素可改善急性缺血性卒中患者的预后，然而也有mata分析指出米诺环素对缺血性卒中患者的预后影响并无任何统计学上的差异［43］，这表明有表明进一步研究米诺环素功能和特异性的必要性，也再次表明药物在缺血性卒中保护BBB的临床转化存在不少的挑战。

我们课题组也进行了治疗缺血性卒中的相关研究。我们发现IL-9可增加BBB通透性并增加动物模型的梗死面积［16，44］，利用向脑实质注射抗IL-9抗体可发现明显的保护BBB及减少梗死体积等正向作用；另一方面，已有大量证据［45-47］证明间充质干细胞（mesenchymal stromal cells，MSC）通过减少脑损伤部位及全身炎症反应、保存BBB完整性等方面来增强患者功能恢复并改善中风后的神经功能，本课题组发现MCP-1（CCL-2）在卒中发生后在梗死区表达迅速上升［48］，基于此，我们将MSC过表达MCP-1的相应受体CCR2，借此令更多的MSC进入至脑梗死区，从而更好地发挥治疗作用。此外，我们认为卒中后给予二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）治疗，不仅可以减少外周免疫细胞进入梗死灶，并且使得巨噬细胞向M2型极化，增强其吞噬能力而减少其致炎作用［49］。

3 结论

本文通过从不同细胞在IS后的作用来阐述BBB通透性的变化情况。完整的BBB功能可以为卒中后脑损伤的恢复免受外周细胞影响的同时使局部神经细胞从炎症激活状态转化为神经修复状态。目前对于IS后BBB的保护以及改善IS预后的临床研究不断更新，内科药物的临床转化仍然是目前血管内治疗以及溶栓治疗时间窗或禁忌症存在的情况下的最好办法。因此，更多的有关卒中后BBB的修复研究仍需进一步地探讨。