外泌体在心肌细胞肥大中的作用

秦磊 王占黎 于慧

014040 包头医学院研究生学院(秦磊)；014040 包头医学院第二附属医院检验科(王占黎、于慧)

外泌体通过携带蛋白质、DNA以及微小RNA(microRNA)等介导细胞间信号传导与信息交换。心血管疾病是全人类发病和死亡的主要原因之一[1]。研究发现，外泌体在多种心血管疾病的诊断和治疗中发挥着重要的作用，而心肌细胞肥大是心力衰竭等独立危险因素之一[2]。本文对近年来外泌体在心肌细胞肥大中发挥的作用进行总结。

1 外泌体概述

1.1 外泌体的生物起源

1983年，Pan等[3]和Johnstone等[4]在绵羊的成熟网织红细胞内首次发现了一种非常小的囊泡，并在1987年将这种由细胞分泌的微小囊泡命名为外泌体。现在，外泌体被定义为起源于多囊泡体(multivesicular bodies，MVBs)，直径在50～100 nm的纳米膜囊泡。它们本质上是核内MVBs与细胞膜融合时产生的包裹在单层膜中的多个腔内小囊泡(intraluminal vesicles，ILVs)。外泌体的释放可以由多种刺激引起，包括细胞氧化、衰老、分化、激活、转化及病毒感染。MVBs产生ILVs的过程以及它们怎样与细胞膜融合尚不完全清楚。目前，主要发现两种途径。第一种途径与转运必需内吞体分选复合物(endosomal sorting complex required for transport，ESCRT)密切相关。ESCRT包含0、Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ四个分型，并且均被释放ILVs的内吞体膜吸收。在ESCRT 0、Ⅰ、Ⅱ识别泛素化蛋白，ESCRT Ⅰ、Ⅱ诱导及其他因素的共同作用下晚期内吞体膜内陷，随后ESCRT Ⅲ限制了ESCRT Ⅱ的功能使货物蛋白去泛素化，导致晚期内吞体大量聚集并脱落，最终形成 ILVs[5]。在ESCRT被完全消耗的细胞内产生MVBs，因此神经酰胺途径被提出，该途径依靠内吞体膜的特定脂质成分独立存在，内吞体腔体膜上的脂筏含有大量鞘脂，中性鞘磷脂酶2可以将鞘脂转化为神经酰胺，大量的神经酰胺聚合使MVBs膜性结构域相接合，导致ILVs出芽[6]。总之，ILVs在MVBs中的形成是外泌体生物起源的开始，主要在ESCRT途径和神经酰胺途径的作用下完成。

1.2 外泌体的结构组成和生物学特性

外泌体是直径在50～100 nm，密度在1.10～1.14 g/ml脂质双层膜结合囊泡，几乎存在于所有的生物液体中，负染后在透射电镜下呈圆球状或杯状。有研究表明，外泌体在电镜下的形态与提取方法有关。外泌体内装载的货物包括蛋白质，脂类衍生物、DNA、mRNAs、microRNAs以及其他非编码RNAs。脂质和蛋白质是外泌体膜的主要成分，目前外泌体中典型的蛋白质包括四分子交联体家族成员(CD9、CD63、CD81、CD82)、抗原提呈蛋白(MHC Ⅰ和Ⅱ)、MVBs形成蛋白(Alix、TSG101)。一些蛋白质会被外泌体优先选择，但这一过程是如何产生的还是未知。目前的研究希望通过改善外泌体的分离方法、提高蛋白质的纯度及检测方法使得对外泌体蛋白质组的鉴别更加精确[7]。在外泌体循环的过程中，外泌体源性RNA被相邻或者远距离的细胞吸收后对靶细胞进行调控，其中mRNAs被翻译成蛋白质而microRNAs沉默靶基因，这一现象在免疫应答、癌症、心血管疾病等多个领域被发现。

2 microRNA在外泌体中的装载及临床应用

microRNAs是由17～24个核苷酸组成的内源性小分子非编码RNA，通过互补结合靶mRNA的3’UTR参与靶基因转录和转录后的调控[8]。单个microRNA可能调控数百个基因，占转录总量的50%～60%，表明microRNA具有生物学多向性[9]。外泌体携带重要的microRNA并可通过microRNA直接调控基因表达，将信息传递给靶细胞，在靶细胞中积极促进基因表达的变化，并对所受压力做出反应。Valadi等[10]认为，特定的microRNA序列被定向包装到外泌体内，并且通过微阵列分析表明这些microRNA序列不是随机产生的。目前，microRNA在外泌体中的装载机制主要包括以下四种：(1)在富含microRNA的外泌体中发现一种含有四个核苷酸的序列(GGAG)，该序列与异构核糖核蛋白A2B1(hnRNPA2B1)相互作用参与microRNA的装载；(2)microRNA在转录修饰后以3端尿苷化的形式存在，似乎有助于直接将microRNA转入外泌体；(3)中性鞘磷脂酶2在参与ILVs出芽的同时，其过表达增加细胞外microRNA的含量；(4)AGO 2是一种与RNA诱导沉默复合体相关的蛋白质，参与RNA沉默并且被认为在控制microRNA进入外泌体时发挥了重要作用，敲除AGO 2可以减少外泌体中特定microRNAs的数量[11]。外泌体microRNAs能够稳定地存在于血液、唾液、尿液等多种体液中，其含量和组成在健康人和患者中存在差异，因此外泌体microRNA可作为非侵入性生物标记物来表示疾病的状态。新技术可以从体液中分离纯度较高的外泌体，为疾病的诊断和治疗检测制定更精准、更微创的方案。

3 心肌肥大的发生机制及分类

3.1 心肌肥大的发生机制

心肌肥大与多个信号通路被激活密切相关，包括钙离子及其相关的信号通路，促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)信号通路、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)信号通路和Wnt信号通路等。机械性张力也是心肌肥大的重要因素之一，其在刺激心肌细胞生长的同时促使心肌细胞生成并分泌血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ，Ang Ⅱ)、胰岛素生长因子Ⅰ、儿茶酚胺、内皮素以及一氧化氮[12]。血管紧张素Ⅱ在血管平滑肌内与ATR1结合，通过Ca2+-磷脂依赖性蛋白激酶途径使血管平滑肌收缩，导致血压升高和心脏负荷，儿茶酚胺分泌过量加重心肌细胞损伤并诱发心肌细胞凋亡。儿茶酚胺能够促进心肌蛋白合成及胶原蛋白累积，使心肌纤维化最终导致心脏肥大。内皮素是一种有效的血管收缩肽，在调节心血管功能方面起着重要的作用。内皮素Ⅰ已被证明可以促进心脏成纤维细胞的增殖并诱导心肌肥大[13]。Wnt信号通路在正常情况下关闭，在压力负荷下被激活，阻断Wnt信号通路可降低由压力负荷引起的心肌肥大。

3.2 心肌肥大的分类

心肌肥大主要分为生理性心肌肥大和病理性心肌肥大。生理性心肌肥大表现为心肌细胞横轴扩大、数量增多、心室舒张的适应性增加，常见于运动员及孕妇。生理性心肌肥大是可逆的，在一定情况下提高心脏的储备力和收缩性。病理性心肌肥大是由于心脏在长期的刺激下对氧化应激和超负荷所做出的反应。原发性高血压、继发性高血压以及冠心病等多种疾病都会引起病理性心肌肥厚。心肌肥大早期仍可维持正常的心脏功能，晚期会导致心肌耗氧量增加以及心脏依从性和收缩力降低，最终导致失代偿性的病理性心肌肥大，并容易导致心脏衰竭和心脏骤停[14]。

4 外泌体在心肌细胞肥大中的作用

4.1 心肌细胞源性外泌体与糖尿病心肌病心肌肥大

糖尿病心肌病是糖尿病患者死亡的主要原因之一。糖尿病患者热休克蛋白(heat shock protein，HSP)表达的降低是导致机体多个器官受损的关键因素。研究表明，糖尿病患者的心肌细胞能够释放含有少量HSP20的有害外泌体。在心脏特异性过表达HSP20的转基因小鼠中证实心肌细胞源性外泌体参与HSP20介导的糖尿病小鼠心肌重构。2型糖尿病大鼠心肌细胞分泌的外泌体能够抑制心肌内皮细胞的增殖、迁移和小管形成。此外，含有较高水平HSP20的外泌体能够防止心肌肥厚、心肌细胞凋亡、心肌纤维化，改善心肌收缩功能。因此，含有高水平HSP20的外泌体对糖尿病心肌病心肌肥大及心肌细胞损伤有一定的抑制作用[15]。

4.2 心肌成纤维细胞源性外泌体与心肌肥大

血管紧张素Ⅱ诱导的病理性心肌肥大与心肌成纤维细胞源性外泌体有关。心肌成纤维细胞分泌的外泌体通过旁分泌作用于心肌细胞，使原代心肌细胞中血管紧张素、肾素、AT1R和AT2R mRNA的表达上调，血管紧张素转换酶Ⅱ mRNA的表达下调[16]。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)在血压的调节中发挥着重要的作用。经过肾素-血管紧张素系统产生的终产物Ang Ⅱ不仅调节血管收缩、生长和纤维化等功能，而且通过启动炎症反应增加血管的通透性。Pironti等[17]从心脏压力超负荷小鼠的血清中分离出含有大量Ang Ⅱ Ⅰ型受体(AT1R)的外泌体。在缺失β受体阻滞剂2的小鼠中证明了富集AT1R的外泌体由心肌细胞分泌；将富集AT1R的外泌体注入输入Ang Ⅱ但被敲除 AT1R基因小鼠的心肌细胞、骨骼肌细胞和肠系膜血管，使小鼠血压升高，并有可能进一步提高对RAAS的敏感性，可见AT1R通过转运蛋白β受体阻滞剂2在RAAS中发挥重要作用。Lyu等[16]发现抑制AT1R和AT2R受体可阻断心肌成纤维细胞源性外泌体诱导心肌细胞病理性肥大。此外，心肌成纤维细胞源性外泌体能够激活MAPK、ERK、p38、Akt和JNK等信号通路，促进与表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)和spp1基因相关的Ang Ⅱ的合成和释放。因此，心肌成纤维细胞源性外泌体通过激活心肌细胞中的RAAS系统促进Ang Ⅱ的产生和分泌，最终导致心肌细胞肥大。此外，心肌成纤维细胞源性外泌体富含miR-21_3p并作为心肌细胞肥大的一个重要的旁分泌信号中介。microRNA-21被转移到心肌细胞中，影响microRNA-21_3p目标基因的表达，导致心肌细胞内PDLIM5(PDZ and LIM domain 5)和SORBS2(sorbin and SH3 domain containing 2)的降低，而PDLIM5和SORBS2的降低将会诱导心肌细胞肥大。通过注射“antagomiR-21”获得的microRNA-21药物的药理抑制作用减弱Ang Ⅱ小鼠心脏肥大的发展[18]。

4.3 心肌球细胞源性外泌体与心肌梗死后心肌肥大

自体心肌球细胞(cardiosphere-derived cells，CDCs)移植可以使心肌梗死后受损的心肌再生，但是这一作用的发生机制仍不完全清楚。Gallet等[19]发现，猪的CDCs分泌的外泌体在心肌梗死后的心肌重构中发挥着重要作用，CDCs源性外泌体不仅减少注射部位心肌的纤维化，而且在整个机体内都存在抗纤维化的效果。此外，CDCs源性外泌体阻止由心室重构引起的心肌细胞肥大，明显抑制梗死周围心肌细胞肥厚性生长，有助于心肌梗死周边微动脉的再生。总的来说，CDCs外泌体治疗在急性期和康复期心肌梗死的猪模型中改善了心室重构、减少疤痕、促进血管生成以及增强心肌细胞增殖。

4.4 心肌祖细胞源性外泌体与心肌肥大

心肌祖细胞源性外泌体提高了受损心脏的心肌功能，参与心肌细胞的保护与修复。体外实验[20]表明，氧化应激可能会使心肌祖细胞外泌体的释放增加，心肌祖细胞在H2O2刺激下释放的外泌体更有效的抑制H2O2诱导的H9C2细胞凋亡。氧化应激能够使外泌体中microRNA-21的含量增加，并且microRNA-21通过作用于PDCD4(programmed cell death 4)抑制H9C2细胞凋亡。抑制细胞凋亡能够减弱心肌细胞收缩功能衰退以及代偿性肥大。因此，心肌祖细胞源性外泌体对急性心肌梗死后的心肌细胞肥大有保护作用。

4.5 外周循环外泌体中的microRNA与心肌细胞肥大

急性心肌梗死患者的血清中装载miR-1和miR-133a的外泌体的含量较健康人显著增加。研究发现，miR-1和miR-133a优先在骨骼肌和心肌中表达，miR-133a 通过靶向调节RhoA、Cdc42以及 NELF-A/WHSC2抑制心肌细胞肥大，而miR-1通过靶向作用于Ras GTP酶激活蛋白、Cdk9、Rheb以及纤连蛋白抑制心肌细胞肥大，故携带miR-1和miR-133a的外泌体与心肌肥大的发生机制有关[21]。

4.6 脂肪细胞源性外泌体与心肌肥大

脂肪细胞与心肌组织之间有着重要的联系，但分子机制尚不明确。Fang等[22]发现，携带miR-200a的外泌体作为脂肪细胞与心肌细胞之间的信息传递枢纽。miR-200a在脂肪细胞中表达丰富，在心肌、血管、骨骼肌中几乎不表达，将脂肪细胞与心肌细胞共培养后发现，脂肪组织中过氧化物酶体增殖物激活受体的激活，导致富含miR-200a的脂肪细胞源性外泌体进入循环系统，心肌细胞吸收后通过抑制TSC1的表达及激活mTOR信号通路，诱导心肌细胞肥大。

5 展望

目前，外泌体在肿瘤、细胞免疫以及干细胞治疗等领域的研究较为广泛。但越来越多的研究表明，外泌体及其携带的多种生物活性物质在不同病理状态心肌细胞肥大的过程中发挥着重要的调控作用。外泌体具有独特的生物学结构和功能，其为成为与心肌细胞肥大相关的心血管疾病的早期诊断标记物或药物载体提供新思路。

利益冲突：无