衣原体质粒编码蛋白pGP3致病机制的研究进展

侯淑萍

（天津医科大学总医院，天津300052）

沙眼衣原体是目前最常见的性传播疾病的病原菌[1］，也是导致女性患者发生输卵管阻塞性不孕的主要因素之一[2］。尽管许多学者在衣原体致病机制方面做了大量的研究，但是衣原体的致病机制迄今仍不明确。衣原体携带一个高度保守的7.5 Kb的质粒，研究发现，A型沙眼衣原体质粒缺失株不能引起眼部的病变[3］，沙眼衣原体小鼠肺炎菌株（Chlamydia muridarum，Cm）质粒缺失株在小鼠生殖道中上行感染以及对输卵管的致病能力大大减弱，证实衣原体的质粒在对宿主的致病过程中发挥了关键作用。衣原体质粒共有8个开放阅读框架，编码8个蛋白pGP1-8。通过基因敲除及质粒转化技术研究发现：pGP1，2和 6是质粒的维持因子[4-6］；pGP4上调依赖于质粒表达的基因；与之相反，pGP5则是这些基因的下调因子[6］；最重要的发现是pGP3缺失株与质粒缺失株在小鼠体内的致病性相似，因此推测pGP3是衣原体质粒编码的一个重要毒力因子[7-8］。本文就pGP3致病机制的研究进展做一综述。

1 PGP3是衣原体致病过程中的重要毒力因子

在小鼠经阴道感染Cm后[9］，衣原体需要上行感染到上生殖道并引起输卵管的炎症反应才能导致输卵管阻塞。研究发现，缺乏pGP3的Cm在小鼠下生殖道的繁殖能力降低；上行感染至小鼠上生殖道的能力也降低；而且当Cm缺失pGP3后，经阴道感染小鼠后无法诱导输卵管积水形成；即使将pGP3缺失的Cm经卵巢囊直接注入输卵管，也无法诱导输卵管积水的形成，提示pGP3是衣原体诱导输卵管炎症形成及阻塞的重要毒力因子[6］。不仅如此，pGP3缺乏的L2型沙眼衣原体在感染小鼠生殖道后诱导炎症反应[8］能力也减弱。这些结果提示pGP3可能通过促进衣原体的繁殖、上升感染和诱导输卵管炎症来实现对宿主的致病性。关于pGP3的其他研究结果也支持这一结论：首先，在质粒编码的8个蛋白中，pGP3是唯一的分泌蛋白，在感染的后期可以大量积聚在宿主胞浆内，由于衣原体在包涵体内完成生物合成，任何在包涵体外分泌的衣原体蛋白都可能成为与感染宿主相互作用的毒性因子；其次，pGP3在经生殖道或眼部途径感染了沙眼衣原体的女性中具有免疫原性[10］，提示pGP3可以接触到宿主的免疫系统；第三，pGP3形成一个稳定的三聚体[11］，其c端三聚体结构域与肿瘤坏死因子（TNF）-α[12］受体结合域相似，提示pGP3可能通过激活TNFR1通路诱导输卵管炎症反应。

2 PGP3促进衣原体的繁殖及上行感染的机制研究

有抗菌活性的阳离子多肽被定义为抗菌肽，包括人类α防御素（HADs）或人类中性粒细胞多肽（HNPs）、人类 β 防御素（HBDs）和抗菌肽（LL）-37[13-16］。LL-37是cathelicidin肽Hcap-18的末端切割产物，直接杀死细菌、真菌和病毒。LL-37还通过趋化免疫细胞、调节炎性促进因子/抑制因子的分泌、协调天然免疫和获得性免疫等功能，发挥免疫调节作用。LL-37的小鼠同源物称为cathelin相关抗菌肽（CRAMP）。HNPs主要由中性粒细胞产生，HBDs主要由上皮细胞产生，LL-37或CRAMP是由上皮细胞和中性粒细胞共同产生的。这些细胞外AMPs通过诱导细菌膜中的孔隙形成，有广泛的抗菌活性，是宿主防御的有效第一道防线[15，17］。

衣原体细胞内感染开始于原体（Elementary body，EB）通过内吞作用进入上皮细胞，在细胞质包涵体中，EB分化为非传染性但代谢活跃的网状体（Reticulate body，RB），RB 大量复制向 EB 分化，在感染的后期，宿主细胞破裂，释放出大量EB感染其他细胞，实现衣原体在宿主体内的繁殖及播散。释放后的EB不可避免地会暴露于细胞外黏膜环境中，其中许多宿主黏膜效应物（如AMPs）可以攻击EB。研究发现AMPs对衣原体有杀伤作用：在体外检测了9种AMPs的抗衣原体活性，发现LL-37及CRAMP对衣原体的杀伤作用最强，其次是HBD3和HNP2[18］；包括AMPs表达在内的许多先天免疫效应因子都是由myd88介导的信号通路[19］调控，在MyD88缺乏的小鼠中，Cm上升感染的能力显著增强[20-21］，这提示依赖于MyD88通路的AMPs可以有效抵御衣原体的上行感染。为了实现播散及上行感染，衣原体EB必须克服宿主的这些防御机制。

许多细菌通过释放可溶性因子来对抗AMPs的杀伤作用[22］。衣原体染色体编码的分泌蛋白CPAF已被证明能够降解LL-37并抑制其抗衣原体活性[23］。PGP3是质粒编码的8个蛋白中唯一的分泌蛋白，该蛋白积聚在宿主细胞的胞浆中，在感染的后期，宿主细胞破裂时大量释放到细胞外环境。体外试验证实将pGP3与LL-37/CRAMP预先孵育后可以有效抑制LL-37/CRAMP对衣原体的杀伤作用[18］，因此推测释放的pGP3能够对抗细胞外的AMPs并抑制其抗衣原体活性，从而使子代EB可以安全地感染下一个宿主细胞。

GST融合蛋白沉降技术显示GST-pGP3可以特异性地结合LL-37[18］并形成高度稳定的复合物，提示pGP3可能通过结合AMPs来抑制其对衣原体的杀伤作用。蛋白结构分析结果显示pGP3的中间段为三重螺旋结构[12］，与LL-37相似，GST融合蛋白沉降技术以及体外细胞培养也证实pGP3的中间段不仅可以结合LL-37而且还能有效抑制LL-37的抗衣原体活性[18］。综上提示pGP3可能通过pGP3中间段介导的对LL-37/CRAMP的抑制作用来促进衣原体繁殖及上行感染。

LL-37除有抗菌活性外，还可激活炎症通路，刺激上皮细胞分泌促炎性细胞因子，募集炎症细胞[24］等。一项研究结果发现[1］，pGP3可以抑制LL-37诱导人子宫内膜上皮细胞产生白细胞介素（IL）-6和IL-8；抑制LL-37对中性粒细胞的趋化功能。因此，pGP3除了抑制LL-37抗衣原体活性外，还能抑制LL-37促炎活性，延缓了炎症的发生，从而有利于衣原体繁殖和上升感染。

3 Pgp3诱导输卵管纤维化形成的机制研究

沙眼衣原体感染女性生殖道后导致的严重后遗症是持久且不可逆的输卵管纤维化，这种纤维化导致了输卵管阻塞性不孕。并非所有由衣原体引起的输卵管炎症反应都会导致持久的纤维化，因此，何种炎性反应会导致输卵管的纤维化是目前的一个研究热点。中性粒细胞的寿命已被证实有助于衣原体诱导输卵管的持久纤维化[25-26］，IL-8作为中性粒细胞趋化因子，能够延长中性粒细胞的存活时间；IL-6在衣原体诱导输卵管纤维化中也发挥了关键作用[27］。

衣原体可以激活多个炎症信号通路从而引起输卵管的炎症反应，其中研究比较多的是Toll样受体-2（TLR2）及TNFR1信号通路。研究发现TNFR1信号通路在衣原体致输卵管病变的过程中发挥了重要的作用[28］，其可能机制如下：TNF-α与TNFR1结合激活3条通路，包括NF-кB信号通路、JNK通路及细胞凋亡的信号通路，诱导凋亡、刺激细胞产生促炎症因子如IL-1、IL-17、MCP-1以及抑制胶原吞噬通路最终导致纤维化，临床上表现为输卵管炎症及堵塞。蛋白结构分析显示pGP3 C端三聚体区域与TNF-α的受体结合区域相似，推测pGP3可能会直接结合TNFR1从而激活信号通路，引发炎症反应[29］。体外研究已证实pGP3能够刺激巨噬细胞和中性粒细胞分泌炎性细胞因子IL-6和IL-8[1］，这可能是pGP3诱导输卵管炎性病理变化形成的机制之一。另一个发现是结合LL-37后pGP3刺激中性粒细胞分泌IL-8和IL-6的能力明显增强，提示pGP3/LL-37复合物可能触发并维持IL-8和中性粒细胞之间的自分泌信号，从而形成一个自我持续状态，使得炎症反应持续存在，最终导致不可逆的输卵管纤维化[1］。

4 总结

近些年来，衣原体感染越来越普遍，已严重危害到人类健康。衣原体疫苗的研制尽管已经开展了几十年，但目前尚无成功的衣原体疫苗问世。通过全面了解衣原体的致病机制，寻找有应用价值的分子靶点，将对有效预防和控制衣原体感染意义重大。多项研究表明，pGP3是衣原体质粒编码的对生殖道致病的重要毒力因子，对其致病机制的揭示将为临床治疗沙眼衣原体感染、降低感染所致输卵管性不孕的发生率提供新思路。