人血浆中雷贝拉唑与氯吡格雷测定方法及存在的问题

倪一帆

（浙江大学医学院附属第二医院 浙江 杭州 310000）

1.国内外研究现状

氯吡格雷是一种噻吩并吡啶类衍生物，其作用机制是可以抑制二磷酸腺苷（ADP）与血小板受体P2Y12结合，使纤维蛋白原无法与糖蛋白GPⅡb/Ⅲa受体结合[1]，实现抗血小板聚集作用及抗血小板形成的作用。现在应用于动脉粥样硬化患者的预防脑卒中、心肌梗死等急性缺血事件的发生。通常氯吡格雷和阿司匹林的联合使用，比在急性冠脉综合征患者单独使用阿司匹林有显著减少死亡率、非致命性心梗死、中风等的风险。

氯吡格雷和阿司匹林的治疗降低了急性冠脉综合征的复发率，但是经常引起消化道的出血、消化不良等不良反应。为了减少不良反应，质子泵抑制剂（雷贝拉唑）被应用在氯吡格雷和阿司匹林的治疗中，来减少消化道出血的风险。雷贝拉唑是一种抑制分泌的药物，无抗胆碱和抗H两组胺特性，可以在胃壁细胞表面通过抑制H+/K+-ATP酶活性[1]，阻断胃酸分泌的最后环节,抑制胃酸的分泌，从而产生抑制氯吡格雷的不良反应。

但是，一些报道中提到氯吡格雷和雷贝拉唑可能在人体内发生互相作用，而使氯吡格雷的抗血小板聚集作用降低。

为了证明这一现象，研究者们研究了氯吡格雷在体内代谢的过程。氯吡格雷是一种前药，它被吸收到体内后有85%通过水解酯酶水解生成没有活性的羧酸盐衍生物，还有一小部分母体化合物通过肝脏生物转换的氧化作用后形成2-氧基-氯吡格雷，主要由细胞色素P450同功酶2B6和3A4调节。再经过水解反应形成活性代谢物，一种硫醇衍生物。而雷贝拉唑也可以通过肝药酶途径代谢，通过竞争抑制CYP2C19和CYP3A4同工酶来降低氯吡格雷的临床作用[5-6]。

从临床回顾性研究中来看，氯吡格雷和雷贝拉唑有互相作用。现有的临床回顾性研究尚存在一定的局限性：（1）和对照组相比,使用雷贝拉唑的患者往往有更多并发症,比如肾功能不全,糖尿病等,这些因素可能使血小板的聚集程度加剧,也是影响氯吡格雷发挥治疗效果的主要因素；（2）其他一些影响心血管疾病转归的因素,如吸烟、非处方类PPI 的使用情况等并未在现有的研究中列出[3]。

目前尚缺少两者相互作用的直接证据，即药代动力学相互作用研究。

2.测定方法

为了可以更好的观察氯吡格雷和雷贝拉唑有的互相作用是否存在，需要开展氯吡格雷和雷贝拉唑相互作用的人体药代动力学研究。人体血浆中氯吡格雷及代谢产物或单独测定雷贝拉唑方法均已有文献报道：

2.1 氯吡格雷及其代谢产物在血浆中含量的测定方法

2.1.1 氯吡格雷在人血浆浓度的液质联用测定法[7-9]

由刘淼[9]，等研究者发表在中国临床药理学杂志，液质联用测定法测定人血浆中的氯吡格雷浓度。该法血浆预处理用0.5ml血浆，使用叔丁基甲醚进行液-液提取。流动相为乙腈-水（含有10mmol/L的醋酸铵，调节pH为4.0）（70:30）。使用正离子检测，扫描方式是多反应监测，测定化合物的母离子和子离子。灵敏度为10pg/ml。

结果为氯吡格雷的线性范围为10～12000pg/ml，最低定量浓度为10pg/ml。

本方法优点：使用液质联用方法，可以增加检测的灵敏度；使用叔丁基甲醚液液提取方法，提取效果好、操作简单减少了误差和杂质的影响；流动相选择乙腈-水体系使出峰时间提前。可适用于血药浓度监测、群体药代动力学/药效学和临床个体化给药的研究。

2.1.2 RP-HPLC法测定人血清中氯吡格雷浓度的方法

由王夏芹[10]，等研究者在安徽医药期刊上发表，使用反相高效液相色潽法测定人血清中氯吡格雷的含量。样品预处理方法是取0.5ml血清，分别使用二氯甲烷、乙酸乙酯、乙酸乙酯：二氯甲烷(80：20)液-液提取法。使用流动相为磷酸二氢钾溶液-甲醇（使用磷酸调pH至3）（35:65）。使用紫外检测器，检测波长为235nm。

结果为氯吡格雷的标准曲线范围为0.625～4.0mg/L,最低定量浓度为0.0625mg/L，取对照品溶液经水稀释后，按信噪比大于5的要求，结果本品最低检测限为0.00313mg/L。提取回收率、方法回收率、日内日间RSD、准确度等标准符合SFDA的相关要求。

使用流动相磷酸二氢钾溶液-甲醇为35:65，可以是氯吡格雷的保留时间在14.5min左右，基本能满足临床上快速测定人血清中氯吡格雷浓度的要求。使用二氯甲烷提取效果比使用乙酸乙酯和乙酸乙酯：二氯甲烷(80:20)提取效果好，缩短了提取时间，减少了人工和延长了色谱柱的使用寿命。为检测氯吡格雷的血药浓度提供了简单可行的方法，还可用于氯吡格雷药物代谢动力学的研究。

2.1.3 LC-MS/MS法同时测定人血浆中氯吡格雷及其羧酸代谢物的浓度[11-12]

由樊宏伟[12]，等研究者发表在中国新药与临床杂志中。该方法可以同时测定血浆中氯吡格雷和其羧酸代谢物的浓度。血浆预处理的方法是取0.5ml血浆，使用乙醚：正己烷=4：1（v：v）2次液-液提取法（中性和酸化条件下），采用那格列酮和吡格列酮这两种内标物质。其流动相是甲醇-0.1%甲酸（80：20）。以多反应离子监测方式监测母离子和子离子。

结果为氯吡格雷的线性范围为5～5000ng/L，最低定量限为5ng/L；SR26334的线性范围为20～2500ug/L，最低定量限为20ug/L。

优点在于使用检测方法为串联质谱，最低检测限可以达到1ug/L以下，灵敏度高。使用乙醚：正己烷=4：1（v：v）2次液-液提取法可以提高氯吡格雷和SR26334的回收率。两种内标在实际使用中可以选择一种。该方法可用于氯吡格雷的新药临床研究,也可用于ACS病人及其他需长期治疗的病人氯吡格雷及SR26334血药浓度的常规的监测。

2.2 雷贝拉唑含量在血浆中的测定

2.2.1 HPLC-MS法测定人血浆中雷贝拉唑的浓度及其药动学 由王晓辉[13]等研究者在中国临床药学杂志上发表，建立人血浆中雷贝拉唑的HPLC-MS测定方法。血浆样品预处理，取血浆500ul，使用乙酸乙酯进行液-液提取。流动相使用乙腈-水（75：25）。使用质谱检测，采用正离子方式检测。

结果为雷贝拉唑的标准曲线范围为20～1000ug/L，最低定量浓度为20ug/L。

实验所用的方法优点为专属性强、简便快速、重现性好、灵敏度高，适用于雷贝拉唑钠肠溶片的体内药动学和生物等效性研究，为雷贝拉唑的临床药动学研究提供了一种新的分析方法。

2.2.2 高效液相色谱法测定血浆中雷贝拉唑的浓度 由扈本荃[14]，等研究者在中国药学杂志上发表，建立高效液相色谱法测定血浆中雷贝拉唑的浓度。取血浆1.0ml，使用醋酸乙酯进行液-液提取。流动相：0.05mol/L磷酸二氢钾缓冲溶液（用0.1mol/L的氢氧化钠调节pH为7）一乙腈(69:31)。使用紫外检测器，检测波长为284nm。

结果为雷贝拉唑的标准曲线范围为5.46～2184.61ug/L，最低定量浓度为5.46ug/L。

流动相中使用缓冲盐，可以使用出峰时间更为理想并且无血浆杂质峰的干扰。但是缺点是使用盐浓度过高，会影响柱子的寿命，而每次冲洗柱子时要花费更多的时间。而缓冲液的浓度会影响实验方法的提取率。本法准确、灵敏，适于雷贝拉唑药动学研究。

3.存在问题

目前报道的方法中，大都为氯吡格雷的测定或者氯吡格雷以及其无活性羧酸代谢物的测定方法，对于氯吡格雷活性代谢产物硫醇衍生物的报道很少见。氯吡格雷的硫醇衍生物是观察两者相互作用比较理想的指标，但是氯吡格雷的硫醇衍生物在血浆中可能不稳定而氯吡格雷硫醇衍生物又是氯吡格雷相互作用的关键指标。此外，由于氯吡格雷和雷贝拉唑相互作用研究需要同时测定多种成分（包括氯吡格雷、代谢产物、雷贝拉唑），目前尚无方法可以同时测定，亟需建立一个同时测定氯吡格雷、氯吡格雷代谢产物和雷贝拉唑的方法，为氯吡格雷的相互作用研究提供支持。