对直肠癌新辅助放化疗敏感性研究的若干探讨

王阁，肖何，陈川

随着放射治疗技术的进步，放疗在结直肠癌的综合治疗中具有越来越重要的地位。特别是，对于Ⅱ～Ⅲ期局部晚期直肠癌(locallyadvancedrectalcancer,LARC)，新辅助放化疗可以显著提高局控率和保肛率而成为标准治疗方式[1-2]。新辅助放化疗后肿瘤退缩分级(tumorregressiongrading,TRG)在临床实践中受到特别关注：达到DworakTRG病理学完全缓解(pathologicalcompleteresponse,pCR)(TRG4)患者具有良好预后，而且将TRG纳入到AJCC临床病理分期可以进一步促进复发风险评估的准确性[3-4]。因此，大量研究探讨了通过治疗前临床特征[5]、肿瘤组织病理学特征[6]、影像组学特征[7]和肿瘤内在放疗敏感性[8-12]等方法预测pCR的可行性。其中，基于肿瘤内在放疗敏感性的pCR预测模型不但在临床实践上有重要意义，而且还具有揭示直肠癌放射抵抗机制的潜在价值。本文就研究策略、既往研究方法的缺陷和进一步分析的方向对基于放疗敏感基因表达构建预测模型的多项研究进行论述。

1 一般研究策略和模型的构建方法

总体上，该类研究一般采取在放疗敏感和抵抗细胞系或肿瘤中利用mRNA微阵列芯片或转录组测序(transcriptomesequencing,RNAseq)筛选与放疗敏感性相关基因或差异表达基因(differentiallyexpressedgenes,DEGs)，再利用网络调控分析[8]或按照基因显著性排秩[11]得到候选基因，并联合各种特征选择算法如支持向量机[11]构建pCR预测模型，以实现在最小冗余最大相关条件下得到稳定模型，并在独立验证集中验证。

在这种研究策略中，最终纳入预测模型的基因种类和参数是决定模型可重复性的重要保证。尽管特征选择算法在同组人群中决定模型预测效能上存在些许差异[11]，但是训练集样本量、总RNA提取起始材料(细胞系/肿瘤组织)、肿瘤组织样本内非肿瘤细胞成分和含量等因素导致预测模型在各研究组间的不一致远胜于所用算法。因此，本文主要讨论以上因素对LARC新辅助放化疗敏感模型构建的影响及相关考虑因素，对算法不作讨论。

2 多种因素导致现有研究方法的不足

2.1 体内外数据对构建模型的影响

迄今，在纳入模型候选基因的筛选上，一是利用体外细胞系2Gy电离辐射后的生存分数(survivalfractionat2Gy,SF2)，采用线性回归等方法筛选其mRNA表达值与SF2值显著相关的基因作为放射敏感基因[8-9]。二是利用实际接受新辅助放化疗治疗病例，评估肿瘤退缩等级后分为pCR组与非pCR组或者分为缓解组(TRG3/4)与未缓解组(TRG0-2)，分析新辅助治疗前肿瘤组织基因的DEGs[10-12]。利用多种肿瘤细胞系(NCI-60细胞系)SF2值构建放疗敏感模型的经典方法最早由Eschrich等[8]建立，并且该10基因模型在小样本量的直肠癌新辅助治疗病例中得到验证[13]。然而，体外条件下测定细胞系SF2值缺乏体内诸多因素，比如乏氧、血管生成、浸润免疫细胞等。事实上，体内肿瘤组织筛选的放疗敏感基因不一定都可在体外细胞系实验中得到验证[12]。如果考虑到肿瘤病灶浸润边缘CD8+细胞毒性T淋巴细胞含量对新辅助放化疗的增敏作用[14]，以及乏氧条件下诱导上皮间叶转化(epithelial-mesenchymaltransition,EMT)对新辅助放化疗的抵抗[6,15]，体外SF2值构建放疗敏感模型由于缺乏这些因素有不可避免的缺陷。总之，由于肿瘤细胞与肿瘤微环境内如肿瘤相关性成纤维细胞的相互作用而导致对化疗、放疗抵抗等因素[16]，基于体内肿瘤组织基因表达水平构建新辅助放化疗敏感模型似乎具有更高的临床适用性。尽管如此，基于肿瘤组织基因表达筛选放疗敏感基因在不区别肿瘤细胞和肿瘤微环境细胞亚群条件下进行RNAseq或微阵列芯片检测有严重弊端，下文即将讨论。

2.2 发现集样本量对从体内肿瘤组织构建模型的影响

已发表研究中发现集样本量从22～77例不等，均属于小样本量研究[10-12]。而且，这些研究都没有考虑筛选放疗敏感基因的发现集样本量问题。但是，该类研究中发现集样本量对候选基因的确定和预测效能有很大影响。在发现集样本量较小情况下，基于统计量显著性排秩的方法选择基因具有较大的不确定性和预测效能的不稳定性[17-18]。经验研究提示，对于预测如雌激素受体阳性等简单的二分类结局变量而言，训练集样本量60例是个临界值，大于60例训练集均可达到稳定的预测效能。

但是，对于LARC新辅助放化疗该经验规则并不充分。从几个研究纳入最后预测模型的基因种类几乎完全不重叠即可得到间接证明[10-12]。而且，早期研究中，虽然模型在发现集中有较高的预测效能，但是在独立验证集中却只有很差的灵敏度(50%～86.6%)[10-11]。推测人群间肿瘤异质性是导致各研究组报道的预测基因种类不一致并且在独立验证集中验证失效的主要原因。我们综合分析GEO(GeneExpressionOmnibus)数据库4个利用微整列芯片法检测基因表达水平的GSE35452、GSE46862、GSE68204和GSE53781数据集共174例病例也得到类似结果：反复取样分析表明在121例训练集中构建的TRG3/4预测模型在53例验证集中的预测效能相当低(未发表数据)。以上分析和既往研究结果说明，基于未分类全体人群中筛选和构建预测模型的效能由于个体间强烈的肿瘤异质性而大打折扣，提示在结直肠癌分子分型的基础上筛选放疗敏感基因的思路对预测模型改进的可能性。

2.3 肿瘤微环境细胞造成肿瘤细胞基因表达评估偏倚与混淆

尽管基于肿瘤组织基因表达构建模型可以将体内肿瘤微环境等因素考虑在内[10-12]。但是，由于现有RNAseq或微阵列芯片检测均是对肿瘤细胞和间充质细胞混杂总RNA进行分析，得到的基因表达水平将受到肠镜取样偏倚以及由此导致的肿瘤细胞含量和其它细胞组分占比的严重影响[19]。该缺点对构建放疗敏感模型和临床应用会产生如下不良影响：①间充质细胞或滤过性免疫细胞等非肿瘤细胞基因表达值对肿瘤细胞内在放疗抵抗基因表达值测定产生干扰。②无法独立评估滤过性免疫细胞参与放化疗增敏机制与肿瘤细胞内在放疗抵抗机制。在没有考虑肿瘤微环境的体外构建模型策略中，此问题将更加严重。

比如，Torres-Roca等人建立的10基因放疗敏感模型中纳入了2个干扰素通路基因(STAT1和IRF1)，而且49个干扰素通路基因中有36个与射线诱导DNA损伤抵抗正相关，具有显著的功能富集[8,20]。但是，研究表明肿瘤细胞基因组DNA片段可异位到瘤体内浸润的树突状细胞胞浆内，激活胞内TBK1和IRF3诱导β干扰素产生，促进机体抗肿瘤免疫活性，介导放疗免疫效应[21-22]。如此，干扰素通路在肿瘤细胞中参与放疗抵抗，而在肿瘤微环境中通过树突状细胞中则参与放疗增敏。要精确的根据纳入模型的基因表达来预测放疗敏感性在混合检测RNA情况下是不可能的。与此紧密相关的是，不区分细胞类型亚群进行分析还将导致现已逐步建立的分子分型的不准确性[19]，而分子分型可能具有建立精确放疗敏感模型的基础。

3 分子分型对模型优化的可能性

结直肠癌分子分型正在逐步转化为疗效预测标志物或指导治疗策略标志物[23-25]。其中，Bramsen等[24]的研究结果对直肠癌放疗敏感模型研究提供了重要参考意义。Bramsen将结直肠癌患者预后生物标志物筛选奠定在分子分型基础上，其结果表明即使是同一类导致劣势预后的生物学机制如EMT，在不同分子亚型中也有不同的分子标签，这些分子标签在不同分子亚型中并不具有相同的预后作用，突出地说明了在如肠癌等群体异质性较强的瘤种中根据分子分型进行标志物筛选在避免异质性难题上的重要意义[24]。更重要的是，Bramsen等人还强调了肿瘤微环境成纤维细胞和免疫细胞影响肿瘤行为的作用：完全基于肿瘤细胞内在基因表达水平(CRCintrinsicsignature,CRIS)的分子分型并不具有对无复发生存时间的预后作用。但是，联合上皮肿瘤细胞和间充质细胞分别具有的生物学特征构建的预后评分在对TNM分期、共识分子分型[26]校正后依然是无复发生存的独立预后因素，如在具有“CD4+CD8+T淋巴细胞活性”、“低间充质活性”和“低免疫抑制”特征的SSC亚型中联合EMT、间质干细胞和IFN-γ分子标签构建的预后评分。此种联合考虑上皮肿瘤和肿瘤微环境细胞进行分子分型和标志物筛选对于新辅助放化疗敏感模型的研究具有重要借鉴作用。

鉴于上述研究，考虑到现有研究结果表明EMT可能是LARC新辅助放化疗抵抗机制之一[6,27]，但是在不区别分子分型情况下筛选到的EMT标签分子可能在不同研究人群中不一致，从而导致预测模型不能相互验证。因此，在基于分子分型基础上进行放疗敏感基因筛选可能具有消除群体异质性影响的作用。

4 进一步研究方向和展望

现阶段，在不独立定量表征上皮肿瘤细胞和肿瘤微环境成纤维细胞和浸润免疫细胞各自生物学特征的情况下，混合检测肿瘤组织总RNA从体内肿瘤退缩数据构建新辅助放化疗敏感模型在不同人群中几乎不具有精确预测能力。考虑到肿瘤细胞与肿瘤微环境相互作用在影响肿瘤生物学行为和介导放化疗抵抗上的作用[16,24]，分别对新辅助治疗前瘤体内上皮肿瘤细胞、成纤维细胞、免疫细胞等亚群进行RNAseq或微阵列分析，分别利用分子分型等工具评估各细胞亚群特征，再与肿瘤退缩等级进行关联性分析是达到构建精确预测模型的基础以及未来的研究方向。

此外，第二种进一步优化模型的方式是在不分离细胞亚群进行混合检测RNA的情况下，精心选着代表各个细胞亚群及其生物学功能特征的基因标签进行分析[19,28]。Trusolino等人利用患者肿瘤组织小鼠移植模型，用小鼠间充质细胞取代人间充质细胞分析基因表达得到CRIS。此外，大量其它肿瘤微环境细胞标签基因，如Moffitt和Angelova分别关于活化的间充质细胞与各种免疫细胞亚群基因标签可用于该类分析[29-30]。

总之，在更精细地区别细胞亚群基础上构建放化疗敏感模型是以后利用高通量技术筛选LARC新辅助放化疗获益人群的必由之路。