miRNA对甲状腺癌诊治各阶段作用的研究进展*

苗雅昕 综述，陈万志 审校

330031 南昌，南昌大学 江西医学院(苗雅昕)；330006 南昌，南昌大学第二附属医院 甲状腺外科(陈万志)

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，据世界卫生组织统计，2015年全球发现甲状腺癌567 000例，占各部位恶性肿瘤总数的3.1%，发病率居第九位，其中女性患病率比男性高3倍，约占女性各部位恶性肿瘤总数的5.1%，发病率居第五位[1]。中国国家癌症中心2019年发布的数据显示，2015年我国甲状腺癌女性发病率达8.49%，居女性恶性肿瘤发病率第四位[2]。另据该机构2015年发布的数据显示，甲状腺癌为30岁以下女性发病率最高的恶性肿瘤[3]。90%以上的甲状腺癌为分化型甲状腺癌，且以甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma，PTC)为主，另外还有分化型甲状腺癌中的滤泡样癌，以及未分化型甲状腺癌(anaplastic thyroid carcinoma，ATC)以及甲状腺髓样癌(medullary thyroid carcinoma，MTC)等类型。尽管流行病学统计显示，与较高的发病率相比其死亡率相对较低，但延迟确诊、治疗不规范等因素也会导致病情的加重、反复或转移，严重影响患者的预后和生活质量。因此，如何合理规范地改进诊疗及建立个性化治疗过程中的手段及方案就显得尤为重要。近年来，针对分子标记物制作个性化诊疗方案日益成为研究热点，而其中以针对miRNA的研究较为集中。越来越多的研究证实miRNA在各类甲状腺癌的发生发展、辅助诊断、治疗以及预后等各方面都可作为重要的分子标记物发挥作用。

miRNA是一种高度保守的单链小分子非编码RNA，约21～23bp，具有转录后调控基因表达的功能。人类miRNAs虽仅占全基因组的1%，但却调控着约30%的人类基因。miRNA通过与信使RNA(mRNA)的3’非编码区(3’-UTR)结合，致使其降解或翻译受阻，进而对基因表达进行负性调控。正是miRNA对靶基因的调控作用，使之在恶性肿瘤的发展各阶段及诊治各步骤发挥作用。此外，竞争性内源RNA假说(ceRNA假说)的提出将miRNA与具有广泛的生物学活性，尤其在细胞生长、分化和致瘤性等方面都发挥着重要作用的长链非编码RNA(LncRNA)联系在了一起[4]。近年来许多研究表明LncRNA在调节甲状腺癌细胞的各种生化活性，在肿瘤发生、血管生成、增殖、迁移、凋亡和分化等方面发挥重要作用[5]。本文将对miRNA与甲状腺癌的相关进展进行综述，以期为进一步的研究提供理论指导。

1 miRNA与分化型甲状腺癌

1.1 miRNA与PTC

1.1.1 miRNA与PTC的发生发展 MAPK通路改变是甲状腺癌中最常见的分子生物学改变，约70%的甲状腺癌是由激活该通路的突变引起的[6]。在甲状腺癌中处于激活状态的BRAF、RAS和RET-PTC等融合基因的突变可引起MAPK信号通路激活。因该通路控制着多种重要的细胞过程，包括细胞的增殖、分化、运动以及凋亡等，故融合基因突变导致的过度激活可造成细胞异常分裂、增殖，促进肿瘤的形成。现有研究表明miRNA与激活该通路相关基因的突变具很强的相关性。Zarkesh等[7]发现在PTC组织和通过细针穿刺活检(fine needle aspiration,FNA)检查怀疑的PTC组织中，BRAF表达产物BRAFV600E的表达频率分别为41.1%和36.8%，并检测出miR-222、miR-181b、miR-214在PTC组织、B-CAPA细胞系及FNA活检组织中均表现为明显表达上调。Titov等[8]的研究发现，miR-146b、miR-21、miR-221、miR-222、miR-375、miR-199b这6种miRNA的表达在BRAFV600E表达阳性的PTC组织中与BRAFV600E表达阴性的组织中明显不同，且miR-146b、miR-21、miR-221、miR-222在所有实验PTC样本中均表现为表达上调。还有研究结果证实，miR-9[9]、miR-9-5p[10]、miR-150-5p[11]都可通过调节BRAF的表达来影响甲状腺细胞的增殖和凋亡，从而参与PTC的形成过程。另外，Liu等[12]发现miR-4728过表达可抑制RAS的正向调节因子SOS1的mRNA水平，从而降低MAPK信号通路活性。Hong等[13]发现miR-20b可通过靶向作用于SOS1和ERK2来抑制MAPK信号通路活性。Shen等[14]还发现miR-106a可直接靶向控制RARB而调控MAPK，进一步作用于PTC发生发展过程。

PI3K-AKT信号通路是生物体内重要的细胞信号通路，其在细胞的生长、发育和凋亡都充当着重要的角色，同样也在甲状腺癌的发生发展中起着重要作用。该通路关键成分有AKT、PI3K、PI3KCA、PTEN及mTOR等，其中PTEN是负向调节AKT基因活性的蛋白激酶，在PI3K-AKT通路中起关键调节作用，而激活mTOR又可导致PTEN的失活，进而激活整个PI3K-AKT通路。PI3KCA可导致基因突变，但PI3KCA突变作用和PTEN失活状态几乎不存在于PTC中，而在甲状腺滤泡状癌(follicular thyroid carcinoma,FTC)和ATC中较为常见。已有研究表明miR-497可通过调控AKT3抑制PTC细胞增殖[15]，miR-21可介导抑制PTEN表达的AP-1进而促进PTEN的表达[16-17]，miR-486也可通过抑制PTEN的表达参与增强PI3K-AKT通路的信号传导[17-18]。Mardente等[19]发现miR-221/222可通过调节受AKT途径调节抑制的P27Kip1来控制PI3K-AKT途径，从而对B-CPAP细胞系的增殖起促进作用。此外，Liu等[20]发现miR-363-3p可直接与编码PI3KCA的mRNA结合，降低其mRNA和蛋白产物的表达，进一步抑制了PI3K-AKT信号通路。Minna等[21]则发现在PTC中miR-451a可通过靶向控制AKT/mTOR通路起到对肿瘤组织的抑制作用。另外，碘和促甲状腺激素也是甲状腺癌发生发展相关的重要因素，二者也通过PI3K-AKT通路对PTC发挥作用。

NF-kB信号通路在生物体内作用广泛，也在肿瘤形成过程中起重要且复杂的作用。其可促进细胞因子、趋化因子、生长因子等产生共同构造肿瘤微环境，还可增加抗凋亡基因的表达[22]。它与许多参与MAPK信号通路的蛋白表达水平的上调相关，如MAPK、BRAFV600E、RAS、RET-PTC等，这些蛋白的异常表达同样会异常激活NF-kB信号通路，从而促进肿瘤的发生发展[23]，故上文中提到的可调控MAPK信号通路中相关蛋白的miRNA也同样会对NF-kB通路产生作用，如miR-146、miR-221、miR-222等。此外，PTEN可抑制NF-kB通路的异常激活，因此PI3K-AKT信号通路的相关改变可抑制PTEN表达的miRNA异常表达，也可激活NF-kB信号通路，为甲状腺癌的发生发展提供有利环境[24]。与NF-kB通路调节情况相似的还有RASSF1-MST1-FOXO3信号通路，它既受到BRAFV600E的直接调节[24]，其中的FOXO3又可受PI3K突变介导，此通路已被证实是介导甲状腺癌发生发展的重要通路之一[25-26]。

miRNA除通过上述常见相关信号通路参与调控PTC的发生发展外，还可通过调控其他信号通路或直接调控相关基因的表达对PTC的发生发展起调控作用。Song等[27]发现miR-96可能在PTC中通过抑制FOXO1和调节AKT/FOXO1/Bim通路发挥致癌作用；另有研究结果显示miR-23b和miR-29b通过调控SMAD3[28]、miR-146b通过调控SMAD4[29]及miR-663[30]通过调节TGFβ通路对PTC发生发展过程起调节作用。Xue等[31]和Qiu等[32]分别发现miR-557和miR-613可通过靶向作用于SphK2抑制PTC的增殖过程，Wen等[33]发现PTC细胞中的miR-126的上调可通过靶向LRP6抑制细胞增殖，Yi等[34]发现miR-1270可能通过自身表达的下调调控SCAI抑制PTC细胞的体内和体外发育，Sun等[35]发现miR-144可通过调控E2F8在体内外调节PTC细胞的增殖。Wang等[36]发现LncRNA PTCSC3可吸收miR-574-5p，与之控制的靶基因形成PTCSC3-miR-574-5p-Wnt/β-catenin信号调节通路介导PTC-1细胞的增殖和迁移，表明Lnc RNA也会通过调节miRNA表达对PTC的发生发展起到作用。

1.1.2 miRNA与PTC的临床病理特点 许多学者通过微序列分析和荧光定量逆转录聚合酶链锁反应(quantitative reverse transcription polymerasc chain reaction,RT-qPCR)等方法对不同PTC患者血清中的miRNA水平进行分析后，发现血清内不同miRNA的表达量可导致患者的临床病理表型出现差异，如淋巴结转移情况、肿瘤直径及有无局部侵犯等。虽然PTC分化程度较好，10年生存率可达90%以上，但早期侵袭性临床病理特征仍可对患者的生活质量造成一定影响。2015年，Lee等[37]研究了良性甲状腺病变(n=19)，乳头状甲状腺患者淋巴结转移(n=45)和无淋巴结转移(n=25)的韩国人血浆样本中的miRNA谱，发现与良性组相比，PTC患者miR-146b和miR-155的表达显著增加，miR-221/222表达也较高但差异并不显著，并且其还发现miR-146b、miR-155和miR-222的过度表达与肿瘤的大小相关。Sun等[38]发现，miR-146a也与PTC的淋巴结转移、局部侵犯和多灶性密切相关。Liu等[39]发现miR-214在PTC组织中表达下调，而与对照组相比，模拟miR-214高表达的组织迁移能力下降，而敲低组则显著增加，表明miR-124可降低PTC细胞迁移和侵袭，抑制上皮间质转化。Todorovic等[40]对比PTC与非肿瘤组织，发现25%的miR-92a过表达，75%表达降低，且其表达水平下降具统计学意义，miR-92a表达与VHL的表达水平相关，可能与PTC的侵袭性相关。Peng等[41]对比了PTC与甲状腺良性结节的miRNA表达，发现与恶性样本相比，miR-30a-3p在良性样本中表达下降，而miR-146b-5P和miR-199b-5p过表达；在肿瘤直径小于1cm的样品中miR-30a-3p、miR-199b-5p下调，miR-146b-5P上调，在大于1cm的样品中也表现出相同的趋势；有淋巴结转移者miR-199b-5P表达上调，故miR-199b-5p或可用于预测PTC的淋巴结转移。

Hu等[42]对比了266例PTC患者、280例结节性甲状腺肿和300例健康组织的miRNA表达水平发现，PTC组织中miR-940、miR-15a和miR-16的表达量明显低于另两组纳入统计的组织，且双侧肿瘤PTC组织中miR-940、miR-15a表达水平低于单侧肿瘤，多中心PTC组织中miR-15a、miR-16表达水平低于单中心肿瘤，锥体外侵袭、颈淋巴结转移或远端转移阳性的PTC组织中三者表达水平与阴性组相比均降低；IL-23表达水平上升，且在双侧肿瘤组织、颈淋巴结转移和远端转移的组织中表达量更高，揭示了这三种miRNA与PTC临床病理特点之间的关系。

已有大量研究结果表明miRNA与PTC的各种临床病理特点有关，但仅有部分miRNA已被证实直接参与一些病理特点的形成且已有研究较为详细的机制及相关通路关系，目前临床上还需miRNA检查与其他检查方式配合才能确切的检测其临床病理情况，并针对其情况给出合适的治疗方案及预后监测方案。

1.1.3 miRNA与PTC的诊断和预后 流行病学研究表明，居住在碘充足地区约5%的女性和1%的男性有可触及甲状腺结节，然而到60岁时，一般人群中估计约50%至少有1个甲状腺结节[43]，而其中仅有5%～15%的结节为恶性[44]。在诊断工作中，首先要进行的是测量血清中的促甲状腺激素浓度，以区分出很少为恶性的功能性甲状腺结节。当怀疑为非功能性结节时，一般会行超声引导下的FNA。然而FNA检查的准确性及应用范围有限，且易造成过度医疗。PTC患者50%以上均有淋巴结受累情况，而术前颈部超声一般仅能检查出手术中发现的受累淋巴结的一般数量。虽然目前FNA仍为临床上确诊甲状腺癌的金标准，但在精准医疗发展速度日益加快的今天，寻找更加有效的PTC诊断及术前检查的方法显得尤为重要。有研究发现，miRNA可作为分子标志物参与以胞外囊泡为检查对象的液体活检等新兴的临床诊断方法[45]。

早在2008年，Nikiforova等[46]就对多种甲状腺癌进行了miRNA分析，提出miR-146b、miR-155、miR-187、miR-197、miR-221、miR-222及miR-224可作为分析癌组织样本类型的潜在区别的标志物，并对其研究的62例FNA标本进行量化分析后得出结论：当至少1种miRNA过表达超过2倍时，癌症检测的敏感性为100%，特异性为94%，准确性为95%。Agretti等[47]在141份FNA标本中评价同一种miRNA的临床效应时发现，基于miR-146b、miR-155和miR-221表达的决策模型检测正确性为97.7%(在未确定细胞学特征的结节中为59%)，可靠性为78.4%。还有研究发现miR-146b-5p在89%的PTC中高表达，与之对照的是其在大多数FTC、ATC及低分化型甲状腺癌症中均未检测到这一现象[48]。Qiu等[49]对比了73例PTC患者的癌组织标本与癌旁组织，运用半定量RT-PCR检测了miR-146a和miR-146b的表达水平,发现两者在癌组织中有明显高表达，且其表达水平可能与淋巴结转移相关，提示其可能运用于PTC的诊断及术前检查。

miRNA对预后的影响已在多种不同的甲状腺癌如PTC、甲状腺低分化癌(poorly differentiated thyroid cancer,PDTC)等中得到研究。如在PDTC中，miR-23b的表达降低可反映无复发生存率降低，miR-181转录水平的升高可使滤泡型甲状腺乳头状癌的10年无复发生存率由75%降低至18%。尽管相关研究都强调miRNA表达谱所提示的预后情况可能比相关临床病理特征更加准确，特别是在不良预后方面，但相关研究数量较少，还需进一步研究来证明其潜在临床预后价值。

1.2 miRNA与甲状腺滤泡状癌

FTC发病率约占分化型甲状腺癌的12%[44]，但专门研究miRNA与FTC相关发生发展过程及病理诊断等各方面的研究仍较少且并未研究足够深入。2014年，Wojtas等[50]就通过运用芯片对比了11例FTC及其对应的正常组织中的miR-146b、miR-183、miR-199b的表达水平并运用RT-qPCR进行了验证，同时还运用RT-qPCR对比了miR-221的表达水平，发现miR-146b、miR-183和miR-221的表达水平上调，miR-199b则下调且均具显著差异。他们还发现miR-146b和miR-183是通过诱导细胞迁徙和抑制细胞凋亡参与FTC的发生发展过程。Hu等[51]则通过基因芯片技术广泛识别了FTC相关的miRNA，发现miR-7-2-3p、miR-7-5p、miR-130b-5p，miR-144-5p、miR-1179和miR-328-3p这6种miRNA表达上调，miR-767-5p、miR-663b和miR-137则下调，并预测了这些miRNA的相关靶基因。Chi等[52]通过miRNA-mRNA网络分析发现，miR-296-5p、miR-10a、miR-139-5p、miR-452、miR-493、miR-7、miR-137、miR-144和miR-145与相应的靶向mRNA之间存在共调节关系，包括TNF受体超家族11b、苯并二氮杂卓受体外周相关蛋白1、TGF-β受体等，表明miRNA在FTC的发病机制、诊断和治疗中能发挥重要作用。Sun等[53]通过采用RT-qPCR检测了42例FTC患者组织，并在转染结缔组织生长因子(connective tissue grouth factor,CTGF)siRNA和miR-199a模拟物或抑制剂的FTC-133细胞中检测其活力及细胞周期状态，发现miR-199a-5p在FTC组织中低表达，且CTGF的mRNA及蛋白表达量明显高于正常组织，miR-199a-5p模拟物及CTGFsiRNA也下调了CTGF在FTC-133细胞中的表达，通过在G0期阻断细胞周期降低了其生存水平。而转染miR-199a-5p抑制剂后，G2/M期和S期细胞比例增加，CTGF的表达水平增加，细胞活力增强，表明CTGF是miR-199a-5p的靶基因且与FTC的发生发展相关。Calabrese等[54]在基础和过表达的条件下对FTC-133细胞中的RNA进行了RT-PCR分析，发现miR-19a的表达显著降低，且其在过表达条件下可诱导细胞形态学表型改变，促进细胞增殖和存活，减少凋亡，且还改变了甲状腺分化和预后不良的相关基因的表达，包括TSHr、Tg、TTF1和Pax8都显著减少，其中TSHr、Tg、Pax8表现出了时间差异性。Miao等[55]则通过RT-PCR对比了FTC组织及FTC-133细胞系内的miRNA及相关基因之间的关系，揭示了miR-4299通过靶向ST6GAL-NAC4调控人FTC的侵袭性，且可能还有其他影响，但其分子机制仍有待研究。Stokowy等[56]还发现,与FNA相比，仅有miR-3529-3p、miR-7-5p在FTC中表达下调近3倍，仅有miR-3607-3p和miR-411-5p在FTC中表达上调略高于FNA，可用于FTC的鉴别诊断。

2 miRNA与MTC

MTC是一种少见的神经内分泌肿瘤，由甲状腺的C细胞引起，约占甲状腺癌的5%，其侵蚀性较强，大部分都表现出淋巴结转移。该病多发于50岁以上中老年人且女性居多，散发性与遗传性的MTC在miRNA表达方面存在区别。虽然miRNA是甲状腺癌预后评估的重要指标之一，且miRNA已被证实与MTC的病理过程相关，但揭示其在MTC中的作用的文献仍较为少见。Galuppini等[57]随访了130例MTC患者的miR-375表达水平(104例散发性和26例家族性)，持续39个月，发现与正常甲状腺组织相比，所有MTC中miR-375的水平均显著上调，且其表达与肿瘤大小、甲状腺囊内浸润、淋巴结转移的风险及肿瘤分期密切相关;在随访结束时仅有10%(13/130)显示出肿瘤进展相关；此外，他们还发现miR-375高表达与预后最差的患者的结果密切相关，表明miR-375在MTC进展中起着重要作用。Chen等[58]发现miR-9-3p在人MTC组织及TT细胞中表达上调且经RT-PCR验证，且miR-9-3p抑制剂明显抑制了TT细胞的细胞周期进展，而其模拟物则抑制了TT细胞的凋亡，还通过生物信息学预测和荧光素酶报告分析确定膀胱癌相关蛋白(bladder cancer associated protein,BLCAP)是miR-9-3p的靶点，在TT细胞中，BLCAP的沉默显著降低细胞凋亡水平，且不受miR-9-3p的进一步影响，揭示了上调miR-9-3p通过靶向作用于BLCAP调控癌细胞的生长和凋亡，在MTC进展中发挥积极作用。Shabani等[59]通过实时PCR技术分析了30个MTC样品的miRNA表达，发现所有样品中miR-144和miR-34a表达均上调，接受者操作特性曲线分析表明二者在患者体内表达增加具有显著的预测价值，揭示了miR-144和miR-34a的高表达可以被认为是MTC的生物标志物，但未发现二者和靶基因表达之间的关系有统计学意义。而后该团队又发现RET阳性MTC患者的miR-144和miR-34a表达较RET阴性患者显著增加[60]。Joo等[61]发现miR-153-3p可特异性调节RET表达，从而阻碍了异种移植MTC的肿瘤生长，且miR-153-3p与卡博替尼的联合治疗可引起更大的生长抑制并可能逆转录卡博替尼的抗性。另外，Chu等[62]通过原位杂交发现其研究的样本中17个(44%)的原代MTC中miR-21表现出强表达，37个(95%)原代MTC中有LncRNA MALAT1表现为强表达。原代中miR-21和MALAT1的实时PCR表达显著高于正常甲状腺组织，验证了原位杂交中的发现。SiRNAs实验显示MTC衍生细胞系中miR-21和MALAT1表达的抑制导致了细胞增殖和侵袭能力的显著降低，可调节MTC进展，揭示了LncRNA参与MTC发生发展调节的方式。

Mian等[63]对34例散发性MTC、6例家族性MTC和2例C细胞增生症患者的9种miRNA进行RT-qPCR分析和miR-21基因靶点PDCD4的免疫组化表达，发现miR-21、miR-127、miR-154、miR-224、miR-323、miR-370、miR-9 、miR-183和miR-375显著过表达，且在散发性MTC和家族性MTC中，miR-224表达上调与淋巴结阴性、早期诊断等过程相关，揭示了miRNA表达失调可能是甲状腺C细胞癌变的早期表现，miR-224是评估MTC预后的可靠生物标志物。

3 miRNA与ATC

ATC又称间变性甲状腺癌，是甲状腺癌中恶性程度最高的一种，尽管其发病率较低，仅占所有甲状腺癌的5%左右，但其死亡率却占全部甲状腺癌死亡率的14%～50%，中位生存期仅为3～5个月，其中癌症干细胞(cancer stem cell, CSC)的存在是ATC复发率高的原因之一[64]。近年研究结果显示，miRNA在ATC的病理过程中也起到重要作用。Hebrant等[65]分析了11例ATC患者的mRNA表达谱，并与miRNA表达谱进行整合，发现其中4例(36.4%)存在p53突变，2例(18%)存在BRAF突变，1例(10%)存在PIK3CA突变，其中有一个样本同时显示BRAF和p53突变，且发现ATC中表现出18种miRNA表达变化，其中17种下调，1种上调，除miR-144外都未在其他肿瘤组织中表现出下调。Sheng等[64]鉴定了原代ATC细胞与ATC-CSC之间差异表达的17种miRNA，发现其中miR-148a在ATC-CSC中显著下调，其过表达可诱导细胞周期停滞和干细胞特性丧失，并鉴定INO80为其靶基因。Shao等[66]通过CCK-8实验和Transwell实验发现miR-4295在蛋白水平抑制CDKN1A的表达，从而促进了ATC细胞的迁移和侵袭，可作为干预ATC病理过程的潜在靶点。Aherne等[67]通过实时PCR和Western blot分析了miR-25和miR-222对甲状腺良恶性细胞的影响，发现miR-25和miR-222表达分别在8505C(间变性甲状腺细胞系)和Nthyori细胞中上调，且发现二者可直接或间接靶向近100个功能各异的mRNA，miR-25基因靶点对参与细胞黏附的基因有明显的富集作用。Vosgha等[68]通过RT-qPCR检测成功转染miR-205载体和空载体的细胞，发现ATC中的miR-205均有显著的过表达，且认为血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGF-A)和ZEB1为其靶点，表明miR-205可以作为靶向VEGF-A的抗血管生成剂，从而影响基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2和MMP9，还可严重抑制VEGF-A的分泌和内皮形成能力，miR-205还可降低癌细胞迁移能力，抑制癌细胞的侵袭性。还有miR-483-3p、miR-27b-3p、miR-650等许多miRNA通过靶向相对应的基因或其mRNA来参与ATC的发生发展、病理特征、预后和耐药性等各类病理过程。Wang等[69]发现LncRNA UCA1可通过与miR-135a的靶向基因c-myc竞争miR-135a的结合，促进ATC细胞的增殖，可能作为人类ATC治疗的潜在靶点。

4 总结与展望

近年来针对miRNA与各类甲状腺癌的发生发展、临床病理特征、诊断预后等各个方面的关系的研究日渐增加，且已开始通过研究其作用原理联系临床从而开发出miRNA在临床上的各类应用，包括鉴别诊断、治疗及预后监控等各个过程。但目前此类研究较多都围绕分化型甲状腺癌，尤其是PTC的相关研究已相当全面，其他肿瘤相对较少，希望未来可以有更多针对于甲状腺癌更广泛种类进行研究，以增进对甲状腺癌的认识，及更全面地运用miRNA等生物标志物在临床上造福患者，提升其生存率和生活质量。

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