硫化氢代谢与神经保护作用

张书虎，李静，马兰，李晨晔

(哈尔滨医科大学附属第二医院老年病科，哈尔滨 150086)

硫化氢(hydrogen sulfide，H2S)一直被认为是一种透明的有毒气体，具有强烈的臭味，是继一氧化氮(nitric oxide，NO)和一氧化碳(carbon monoxide，CO)后的第3种气体信号分子[1]。近20年通过对H2S病理和生理学方面的大量研究，在H2S产生、分解代谢、抗炎、抗凋亡、促血管生成以及通过抗氧化介导细胞保护方面取得了巨大的成就[2]，包括离子通道、蛋白激酶、转录因子、生长因子及炎症因子在内的多种因素参与H2S介导的信号传导。胱硫醚β-合成酶 (cystathionine beta-synthase,CBS)、胱硫醚γ-裂解酶(cystathionine gamma-lyase,CSE)、含半胱氨酸转氨酶的3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase/cysteine transaminase，3-MST/CAT)和含D-氨基酸氧化酶的3-巯基丙酮酸硫转移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase/D-amino acid oxidase，3-MST/DAO)参与内源性H2S的生成，他们共同的底物即L-半胱氨酸。本文将重点讨论H2S在阿尔茨海默病(Alzheimer disease，AD)、帕金森病(Parkinson disease，PD)、霍奇金病(Hodgkin disease，HD)、肌萎缩侧索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)、热性惊厥(febrile seizure，FS)及脑缺血中的神经保护作用、信号传导途径及其潜在应用。

1 H2S的产生及分解

内源性H2S产生过程中CBS、CSE和3-MST/CAT3种酶的共同底物是L-半胱氨酸[3]。研究表明D-半胱氨酸是一种比L-半胱氨酸毒性更小的半胱氨酸，其在肾脏和大脑中可通过3-MST/DAO途径产生内源性H2S[4]。3-MST途径产生的H2S大部分以硫磺形式存在，硫磺是内源性H2S大量储存的主要形式，同时研究也表明3-MST是内源性硫磺的主要产生者，而不是之前公认的CBS[5]。

1.1 CBS

CBS是一种依赖磷酸吡啶的酶，主要位于小脑、大脑和脑干。CBS可使半胱氨酸通过β消除反应产生H2S,亦可通过半胱氨酸与同型半胱氨酸的β置换反应产生H2S，后者效率更高。表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、转化生长因子-α(transforming growth factor-α, TGF-α)和环磷酰胺等化合物可上调CBS mRNA的表达，并促进CBS基因转录[8]。不同疾病CBS的表达也不同，唐氏综合征患者大脑中，CBS的表达量是正常人的3倍，而高智商儿童CBS的表达却比较低[8]。敲除CBS基因的小鼠表现为高同型半胱氨酸血症和高蛋氨酸血症，由此可知CBS过度表达可能影响认知功能，而CBS缺失则可导致严重疾病的发生[9]。

1.2 CSE

CSE主要分布于肝、肾、血管和非血管平滑肌，作为NO供体的S-亚硝基-N-乙酰基-DL-青霉胺(S-Nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine,SNAP)可上调CSE的表达，而NO的另一供体硝普钠也能提高CSE的活性。研究表明心血管系统产生的内源性H2S可与NO协同参与NO对血管的舒张[10]。CSE在血压调节中的作用仍存争议，CSE普遍被认为在调控血管平滑肌中起重要作用，但也有研究表明血压不受CSE影响的机制是：(1)3-MST/CAT可能参与血压调节；(2) 3-MST/CAT可增加H2S生成以弥补CSE的不足[11]。

1.3 3-MST/CAT

研究表明大脑中L-半胱氨酸和D-半胱氨酸通过3-MST/CAT途径可产生H2S[12]。CBS和CSE主要位于胞浆中，而3-MST主要位于脑和视网膜神经元的线粒体基质中[13]。3-巯基丙酮酸(3-mercaptopyruvate，3MP)由L-半胱氨酸、D-半胱氨酸和α-酮戊二酸合成，胞浆内D-半胱氨酸合成线粒体中的3MP时需过氧化物酶DAO参与[14]。3-MST产生H2S时需二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)等还原物质参与。硫氧还蛋白、二氢硫辛酸(dihydrothioctic acid，DHLA)可与3-MST联合作用释放内源性H2S。线粒体中硫氧还蛋白浓度为20 μmol/L，促进H2S生成作用为DTT的4倍[15]。Ca2+可抑制CAT活性，并呈浓度依赖，在不含Ca2+的情况下H2S生成量最大，Ca2+浓度为2.9 μmol/L时H2S的生成量最小[16]。硫磺为细胞内H2S存储的主要形式之一，因此含3-MST和CAT细胞结合硫磺浓度为其他细胞的2倍，如胞内为无法产生H2S的3-MST突变体，则结合硫磺的浓度较低[17]。

1.4 H2S的分解

大脑神经元兴奋或其他刺激可使结合硫磺释放游离H2S，随后主要由线粒体中的硫代硫酸钠氰化物硫转移酶氧化为硫代硫酸盐、亚硫酸盐和硫酸盐。H2S可被硫醇-S-甲基转移酶甲基化成甲硫醇和二甲基硫磺，亦可与氧化形式的高铁血红蛋白结合。肝、肾和肺血流中游离H2S的浓度低，衰减速度快，故上述器官中游离H2S的清除率较低[18]。

2 硫化氢的神经保护作用

2.1 AD

AD是一种进行性神经退行性变，是痴呆症的主要病因，其镜下特点为老年斑积聚、神经元纤维缠结、突触丧失和神经坏死。发病机制包括氧化应激和神经炎症，AD患者血清H2S水平紊乱具有显著意义，提示内源性H2S可能参与AD的发病过程[19]。Tang等[20]的相关研究表明生理浓度H2S可通过维持线粒体膜电位(mitochondrial transmembrane potential，MMP)和减弱β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)肽25～35片段诱导的活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生来保护神经元[20]，H2S还可通过上调B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)表达水平减少MMP丢失，以保护神经元免受同型半胱氨酸诱导的细胞毒性和凋亡[21]。此外，AD患者过度产生白细胞介素-1α(interleukin-1α，IL-1α)、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-12和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)等炎症因子也有相关报道[22]，且H2S可明显抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的释放，并可抑制环氧化酶-2(cycloxygenase-2，COX-2)上调和核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)的激活作用[23]。越来越多证据表明内质网应激在AD发生或病理过程中起关键作用，其特征是包体形成异常和错误折叠蛋白聚集[24]。体外动物实验证实H2S通过上调脑源性神经营养因子/肌钙蛋白相关激酶B(brain-derived neurotrophic factor/troponin related kinase B,BNDF/TrkB)途径，抑制同型半胱氨酸诱导的大鼠海马内质网应激和神经元凋亡。作为H2S供体的硫氢化钠(sodium hydrosulfide hydrate,NaHS)可增加海马内H2S生成和BNDF表达，并显著降低同型半胱氨酸诱导的海马神经元凋亡和内质网应激反应，TrkB受体特异性拮抗剂K252a可消除NaHS对同型半胱氨酸诱导的海马内质网应激的保护作用，提示H2S对AD患者神经元具有保护作用及潜在治疗意义[25]。

2.2 PD

PD的特点是黑质多巴胺能神经元进行性变性，其发病机制与蛋白质积聚、氧化应激、线粒体功能障碍、兴奋性毒性、神经炎症和凋亡等有关。研究表明6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-HODA)诱导的PD大鼠模型中内源性H2S水平明显降低[26]。1-甲基-4-苯基吡啶离子(1-methyl-4-phenylpyridinium，MPP+)是1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)的活性代谢产物，可刺激超氧自由基产生，诱导PC-12细胞凋亡。MPP+可抑制CBS的表达活性，导致内源性H2S生成减少，而H2S可降低MPP+诱导的细胞毒性作用，减少ROS产生。相关研究已证实H2S可减轻黑质致密部多巴胺能神经元丢失，并通过依赖线粒体的解偶联蛋白2(uncoupling protein 2，UCP2)通道而不是腺苷三磷酸敏感性钾(adenosine triphosphate sensitive K+channel,KATP)通道减少MPTP诱导的神经元变性[27]。研究已经证实H2S对MPP诱导的神经元毒性保护作用中KATP/磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)/Bcl-2途径参与。KATP通道阻滞剂格列本脲和特异性PI3K-PKB通道阻滞剂LY294002可逆转NaHS对MPP+诱导的PC-12细胞毒性的保护作用。NaHS还可上调Bcl-2表达，阻断MPP+诱导的Bcl-2表达下调。神经毒素诱导的神经退行性变模型中H2S可通过抗氧化应激、抗炎和代谢抑制等多种机制发挥神经保护作用。同样，MPTP诱导的PD经典动物模型中，H2S的神经保护作用与血红素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)和谷氨酸-半胱氨酸连接酶等编码抗氧化蛋白基因的上调有关，这种作用得以发挥可能是通过依赖核因子E2相关因子(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)的信号通路完成的。因此，H2S可增强抗氧化防御系统并抑制炎症和细胞凋亡[28]。研究发现PD患者纹状体内Parkin巯基化水平较常下降，含有E3泛素连接酶的Parkin具有神经保护作用，其S-亚硝基化和失活均具有神经毒性，H2S可介导Parkin的巯基化并增强其催化活性，这对PD药物的下一步研究具有重大意义[29]。L-二羟基苯丙氨酸(L-dihydroxyphenylalanine,L-DOPA)杂合物可释放H2S并可通过其抗氧化、抗炎和抑制单胺氧化酶B发挥神经保护作用，通过以上综述可知H2S有望成为一种更有前途的新型PD治疗药物[30]。

2.3 脑缺血

脑缺血是一种发病率和死亡率均较高的神经系统疾病，大脑缺血缺氧可致细胞内Ca2+负荷过大，钙蛋白酶激活，突触囊泡释放大量谷氨酸，进而引起不同程度的神经元损伤，损害大脑功能。H2S可保护胚胎脑免受缺血再灌注损伤[31]。此外，ACS14(一种H2S释放衍生物)可通过增加细胞内谷胱甘肽的生成来减轻谷氨酸介导的氧化应激损伤[32]，同时H2S还可降低谷胱甘肽分解酶的活性，减少谷胱甘肽的分解以维持其在细胞内的正常水平[33]。海马与人类的学习、记忆功能密切相关。NaHS可增强脑缺血大鼠海马区突触的可塑性，抑制脑缺血后锥体神经元周围水肿及核收缩，其分子机制可能为：(1)增加PKB的磷酸化，减少凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase-1，ASK1)和c-Jun N端激酶3(c-Jun N-terminal kinase，JNK3)的磷酸化；(2)使海马CA1区的生长相关蛋白-43(growth associated protein-43，GAP-43)的表达上调。缺血再灌注大鼠模型研究表明，大鼠缺血再灌注后24 h，海马和皮质中H2S水平降低，而应用低剂量NaHS后可减轻缺血再灌注后的神经损伤[34]，NaHS可通过抗氧化、抗炎和抗凋亡作用对全脑缺血再灌注损伤起神经保护作用，其机制可能如下：(1)脑组织超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性增高；(2)抑制还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH)氧化酶P47和gp91亚基mRNA水平；(3)抑制促炎因子TNF-α和单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-1，MCP-1)；(4)促进凋亡蛋白Bax表达；(5)PI3K/PKB/p70核糖体S6激酶细胞存活信号通路激活，且研究人员还发现H2S可通过刺激KATP/蛋白激酶C/胞外信号调节激酶1/胞外信号调节激酶2/热休克蛋白90通路保护细胞免受缺血缺氧损伤[35]。H2S通过PI3K/PKB信号通路增加PKB和细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase，ERK)的磷酸化及血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)和血管生成素-1(angiogesin-1，Ang-1)的表达，促进脑缺血后血管生成和功能改善[36]。

研究发现永久性大脑中动脉闭塞大鼠模型皮质和纹状体中3-MST表达下降。尽管3-MST/CAT与结合硫磺密切相关，但脑缺血时细胞内Ca2+超负荷导致H2S生成停止，而细胞内Ca2+超负荷是如何影响3-MST/CAT通路的机制尚未明确。因此，尽管3-MST/CAT通路是脑内H2S的主要来源，但找到一个可以替代CBS的酶可能是研究H2S在脑缺血中发挥保护作用的更具前景的靶标。H2S对脑缺血起到保护还是毒性作用主要取决于H2S的浓度高低，高浓度时可加重梗死面积，而低剂量时则发挥保护作用。

2.4 FS

FS是高热引起的婴儿和儿童中最常见的病理性脑活动，目前尚未有确凿证据证明短期FS会对儿童的大脑发育产生不利影响，而长期的FS会损害儿童的认知和记忆功能。通过对核磁共振成像的研究可知长时间的FS可造成患儿急性海马损伤。在FS的大鼠模型中，通过应用CBS拮抗剂羟胺可抑制H2S生成进而使海马区极度活跃，给予NaHS后可使神经兴奋性降低。H2S保护海马神经元免受兴奋性毒性的机制可能为：(1)抑制突触传递；(2)逆转GABAB受体1(GABAB R1)和GABAB受体2(GABAB R2)的丢失来实现兴奋/抑制平衡的正常化[37]。FS具有高热的特点，H2S作为氧化磷酸化的一种温和抑制剂，可导致持续的深低温，故H2S可能成为预防复发和长期FS所致脑损伤的一种新的治疗方法。

2.5 其他神经退行性疾病

除了AD、PD、脑缺血等，H2S和其他神经退行性疾病的发病机制也存在着紧密的联系。HD是由亨廷顿基因中的CAG重复扩增的一种异常的多聚谷氨酸所导致的进行性、致命性、神经退行性疾病。据相关数据表明CBS和亨廷顿基因的突变关系密切。从HD患者的血浆中能够明显看到同型半胱氨酸水平升高，表明血浆中同型半胱氨酸浓度差异性有可能和HD的发病机制相关。对HD患者的H2S浓度差异进行研究可能会带来巨大的价值，然而至今相关研究仍较少。而ALS是一种以运动神经元变性为特征的神经退行性疾病，该疾病有10%的患者属于家族遗传。据相关数据显示，发现在转入家族型ALS最主要的致病SOD-1突变基因的模型小鼠中，活化的小胶质细胞和星型胶质细胞极大地促进运动神经元的变性死亡。研究表明神经炎症在ALS未来的发展和研究中有较大的促进作用。此外，谷氨酸的氧化应激、兴奋毒性等机制都参与ALS的发生及发展。虽然现阶段仍缺乏对H2S和ALS相关性的研究，但更多研究证明H2S能够通过抑制胶质细胞活化，释放大量促炎症细胞达到抗炎症效果，同时还有较强的抗氧化应激效果，这对ALS有极大的潜在治疗价值。

3 总结与展望

H2S主要通过抗氧化、抗炎、抗凋亡发挥其神经保护作用，这些作用包括多种涉及异质分子的潜在途径，人类可干预由内源性或外源性H2S诱导的这些途径的上调或下调，例如基因表达和药物在H2S的产生和代谢方面的应用，然而，要实现这些最终目标还需要很长一段时间。尽管我们综述了H2S的神经保护作用，但他实际上是一种双面分子，在各系统中有保护和致病的双重作用。H2S在心血管疾病、神经疾病、精神病变、代谢综合征和糖尿病等方面具有广阔的应用前景，但仍面临巨大的挑战，需要进一步研究以阐明其机制。