女黄颗粒对免疫抑制模型小鼠脾组织病理及细胞周期的影响

闫志强，郑 华，朱买勋，付文贵，张邑帆，翟少钦

(重庆市畜牧科学院，重庆 402460)

免疫系统是机体执行免疫应答及免疫功能的重要系统，具有识别和排除抗原性异物、与机体其他系统相互协调共同维持机体内环境稳定和生理平衡的功能，由免疫器官、免疫细胞和免疫分子组成[1]。脾作为机体最大的免疫器官，含有大量的淋巴细胞和巨噬细胞，其中T淋巴细胞直接参与细胞免疫，并对外周血中T细胞亚群的分布有重要调节作用；巨噬细胞可作为抗原提呈细胞，调节和增强免疫应答。因此，脾组织结构及细胞周期的完整性是行使其免疫功能的基础。现代研究表明，一定剂量的环磷酰胺可显著抑制免疫器官生长，抑制非特异性和特异性淋巴细胞分化，对机体免疫系统有一定损害，因此，被广泛应用于建立动物免疫抑制模型[2]。女黄颗粒是基于中兽医理论对免疫低下疾病的认识，结合中药理论组的中药复方，主要用于调节禽的免疫功能。本研究主要利用环磷酰胺复制小鼠免疫抑制模型，并使用女黄颗粒对其进行治疗，以考察女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾组织病理学及细胞周期的影响。

1 材料与方法

1.1 试验动物

健康昆明小鼠50只，体重(17.0±2.0)g[中国人民解放军第三军医大学实验动物中心，许可证号SCXK-(军)2012-0011]。

1.2 试验药物

女黄颗粒中女贞子、黄芪、枸杞子和菟丝子，其比例为4∶4∶1∶1，药材均购于重庆荣昌区桐君阁大药房，所有中药经过提取后，湿法制粒，制成规格为1.0 g颗粒中含原生药1.0 g，经重庆市兽药饲料检测所测定特女贞苷含量为1.46 mg·g-1。注射用环磷酰胺购自江苏盛迪医药有限公司，批号17020525。

1.3 主要仪器

RM2235石蜡切片机(Leica，德国)，CX21FS1光学显微镜(OLMPUS，日本)，DM1000显微成像系统(Leica，德国)，流式细胞仪(BECKMAN COULTER，CytoFLEX)。

1.4 小鼠免疫抑制模型的复制

参照文献[3]，使用注射用环磷酰胺(用生理盐水稀释)，以80 mg·kg-1剂量腹腔注射，1次·d-1，连续5 d。

1.5 试验分组及处理

动物适应性饲养3 d后，将50只健康昆明小鼠随机分为空白组、模型组和女黄颗粒高、中、低剂量组(用水将女黄颗粒溶解成1.0 g·mL-1，然后按照需要进行稀释)，共计5组，每组10只，自由采食和饮水。除空白组外，其余4组按照“1.4”方法进行造模，造模结束后，空白组和模型组灌胃生理盐水，3个女黄颗粒组分别按0.5、1.0、1.5 g·kg-1剂量灌胃给药，1次·d-1，连续7 d。

1.6 脾指数的测定

在末次给药后次日，将小鼠进行乙醚麻醉后脱臼处死，称其体重，无菌取脾，并称其质量，按公式计算脾指数。脾指数=脾质量(mg)/体重(g)。

1.7 血液学指标的测定

动物处死前，小鼠眼眶后静脉丛采血入EDTA-K2抗凝管。采用全血细胞分析仪检测。检测内容包括红细胞计数、白细胞计数、淋巴细胞百分比和单核细胞百分比。

1.8 脾组织切片制作

4%多聚甲醛固定的组织样本，经流水冲洗30 min，进行组织修块，放入病理包埋塑料筐中脱水，二甲苯透明，浸蜡3 h，包埋组织块于石蜡中。将包埋好的组织切成5 μm厚的薄片，展平放在载玻片上60 ℃烘烤2 h后用二甲苯脱蜡，流水洗涤20 min，苏木素染色30 min，流水洗涤20 min，伊红染色5 min，再经脱水、透明后用树脂胶封片。最后显微镜下观察组织病理学变化，采用显微成像系统拍照记录组织学损伤。

1.9 脾细胞周期检测

取下小鼠脾组织，经机械法剪碎后300目滤布过滤，制成脾细胞悬液，离心，用PBS液调节细胞浓度至106个·mL-1。取1 mL细胞悬液于流式管中，加入1 mL的Triton(0.02%)，4 ℃处理8 min，离心弃上清，加入PI染色液5 μL漩涡混匀，4 ℃染色 30 min，加入1 mL PBS于流式管中，离心弃上清。再加入450 μL PBS重悬细胞，立即用流式细胞仪进行数据采集并用ModFit软件进行数据结果分析。

1.10 数据分析

2 结 果

2.1 女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾指数的影响

如表1所示，与空白组相比，模型组脾指数显著下降(P<0.05)；与模型组相比，女黄颗粒低、中、高剂量组脾指数极显著升高(P<0.01)。

组别Group剂量/(g·kg-1)Dosage脾指数/(mg·g-1)Spleen index空白组Control group—5.68±0.21ABb模型组Model group—3.48±0.15Bc低剂量组Low-dose group0.56.29±0.88Aab中剂量组Mid-dose group1.06.67±0.83Aab高剂量组Hig-dose group1.57.80±0.46Aa

同列数据肩标不同大写字母表示差异极显著(P<0.01)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05),相同字母或无字母肩标表示差异不显著(P>0.05)。下表同

Means in a column with different letters are different, the capital letters meanP<0.01, the small letters meanP<0.05, and there is no difference (P>0.05) for means in a row without letter or with the same letter. The same as below

2.2 女黄颗粒对免疫抑制小鼠血液学指标的影响

如表2所示，与空白组相比，模型组白细胞数、淋巴细胞百分比及单核细胞百分比极显著下降(P<0.01)；与模型组相比，女黄颗粒高、中、低剂量组淋巴细胞百分比、单核细胞百分比极显著升高(P<0.01)。红细胞数无显著变化。

2.3 女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾组织病理学的影响

如图1脾组织切片所示：空白组小鼠脾组织形态结构均正常，白髓区界限较清晰，白髓区的淋巴细胞排列致密，淋巴滤泡结构清晰可见；红髓区富含充有红细胞的血窦。模型组脾组织红髓和白髓分界不清，白髓区和红髓区的淋巴细胞数量均明显减少。女黄颗粒低剂量组脾组织白髓区淋巴细胞数量未见明显减少，巨噬细胞数量较空白组多，红髓区有明显的淤血。女黄颗粒中剂量组脾组织红髓和白髓界限分明，白髓内淋巴细胞较为密集，未见有明显的病理学损伤。女黄颗粒高剂量组脾组织红髓区轻度淤血，局部形成较大的空腔，其内有多量细胞核碎片。

2.4 女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾细胞周期的影响

由表3可知：空白组脾细胞主要处于G0/G1期；经过环磷酰胺刺激后，与空白组比较，模型组处于G0/G1期的脾细胞比率极显著下降(P<0.01)，处于S期的脾细胞比率极显著增加(P<0.01)。与模型组相比，女黄颗粒组G0/G1期脾细胞升高，S期脾细胞比率降低，其中女黄颗粒中剂量组差异均极显著(P<0.01)。

3 讨 论

3.1 女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾指数的影响

脾是免疫细胞定居的场所，能合成补体、干扰素等生物活性物质，同时可清除血液中的病原体、衰老死亡的血细胞及免疫复合物等[4-6]。一般认为，免疫器官质量增加是由于其自身细胞生长发育和分裂增殖所致，是免疫增强的表现，免疫器官质量的降低为免疫抑制所致，表明机体免疫状况变差[7-8]。本试验结果显示，注射环磷酰胺后小鼠脾指数降低，可能是环磷酰胺抑制了脾的生长发育，给药后，脾指数升高，迅速恢复并出现“反跳”现象[9]，推测女黄颗粒中含有大量氨基酸、多糖等脾生长发育所需的营养物质，促进脾生长，并能解除环磷酰胺对脾的抑制作用，增强机体免疫功能。

3.2 女黄颗粒对免疫抑制小鼠血液学指标的影响

淋巴细胞是由淋巴器官产生，是机体免疫应答功能的重要细胞成分。脾作为机体最大的淋巴器官产生大量淋巴细胞进入血液，因此血液中淋巴细胞数间接反映脾的功能。血液学指标检测结果表明：注射环磷酰胺后，与免疫有关的白细胞数、淋巴细胞百分比及单核细胞百分比降低明显，腹腔注射环磷酰胺成功复制免疫抑制模型。给药后，小鼠白细胞数、淋巴细胞百分比及单核细胞百分比均有不同程度的升高，接近空白组水平。女黄颗粒中枸杞、女贞子、菟丝子具有补益肝肾的功能，黄芪健脾益气，诸药合用有健脾补肾功效，可调节血液白细胞数，研究发现，健脾补肾方对白细胞减少症有较好的疗效，本研究结果与文献报道一致[10]。

组别Group白细胞数/(×109·L-1)WBC淋巴细胞百分比/%LYM单核细胞百分比/%MON红细胞数/(×1012·L-1)RBC空白组Control group4.59±0.99Aa74.27±3.39Aa5.62±0.66Aa9.23±1.37模型组Model group2.38±0.31Bb41.00±4.10Dd3.08±0.61Cc9.20±0.57低剂量组Low-dose group3.77±0.77ABa50.00±5.85Cc4.34±0.69Bb9.01±0.75中剂量组Mid-dose group3.83±0.87ABa62.00±4.16Bb4.81±0.74ABb9.72±0.80高剂量组Hig-dose group3.95±0.99Ab64.23±6.17Bb4.62±0.41ABb9.73±0.97

图1 女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾组织学结构的影响(HE染色，400×)Fig.1 Effect of Nühuang granules on spleen histopathology of immunosuppressive mice (HE staining, 400×)

表3 女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾细胞周期的影响

3.3 女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾组织病理学的影响

病理学检查可以从不同水平上反映脏器、组织的健康状态。本试验组织病理学检查结果表明，给药女黄颗粒后，低、中剂量组脾组织有不同程度的恢复，组织结构变清晰，淋巴细胞数量增多，以中剂量组效果最好。据文献报道，中药多糖对受损伤的免疫器官有较好的保护和调节作用[11]，而女黄颗粒中黄芪、枸杞、女贞子中含有大量多糖，可能是发挥调节作用的主要成分。

3.4 女黄颗粒对免疫抑制小鼠脾细胞周期的影响

细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段[12-13]。细胞间期包括G1期、S期、G2期。G1期又称合成前期，此期主要合成RNA和核糖体。S期即DNA合成期，在此期，除了合成DNA外，同时还要合成组蛋白。G2期为DNA合成后期,在这一时期，DNA合成终止，大量合成RNA及蛋白质[14]。G0期的细胞停止细胞分裂，去执行一定生物学功能。本研究结果表明：空白组大部分脾细胞处于G0/G1期，执行生物学功能。模型组在造模后到试验结束时，处于G0/G1期的脾细胞百分比降低，表明脾细胞执行生物学功能能力减弱，免疫功能下降；同时S期脾细胞百分比显著升高，推测此时期为脾的自我修复期。给药后，G0/G1期的脾细胞百分比增多，S期脾细胞百分比降低，表明女黄颗粒能促进脾修复，并通过增加G0/G1期脾细胞增强其免疫作用；同时G2期的脾细胞百分比增多，推测女黄颗粒可通过增加G2/M期的脾细胞，增加脾的免疫性，使脾增重，说明女黄颗粒可以通过调节细胞周期的进程来改善免疫功能。

4 结 论

女黄颗粒可以提高免疫抑制小鼠的脾指数、增加白细胞数、淋巴细胞百分比及改善受损的脾组织结构。