三种小分子化合物对猪胎儿成纤维细胞DNA精确修复效率的影响

李国玲，王豪强，阮晓芳，莫健新，全 绒，钟翠丽，李紫聪，吴珍芳,2，刘德武，张献伟,2*

(1.华南农业大学 动物科学学院,国家生猪种业工程技术研究中心，广州 510642；2.广东温氏食品集团股份有限公司，新兴 527439)

基因组自然产生或人为引入的双链断裂(double-strand break,DSB)是同源定向修复(homologous recombinant repair, HDR)或非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)发生的前提，传统基因操作技术利用供体质粒和自然产生的DSB，整合效率仅仅为10-5～10-7，为科研和生产带来了极大的困难。新的基因编辑技术的出现，如锌指核酸酶(zinc finger nucleases, ZFN)、转录激活样效应因子核酸酶(transcription activator-like effector nucleases, TALEN) 和规律成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palidromic repeats/CRISPR-associated 9, CRISPR/Cas9)系统等[1-3]，可在基因组内高效引入DSB。这些基因编辑工具的出现以及升级和完善，使得基因组产生DSB的效率得到充分的保障，为开发定点整合的模式动物提供了有利的条件。虽然细胞产生DSB的效率得到了极大的提高，但细胞利用HDR介导的DNA精确修复率仍然十分低下，只有大约0.5%～20.0%。而与之竞争的NHEJ发生效率却高达80%[1-3]。由于NHEJ修复方式是强行将2个DNA断端连接在一起，修复过程中容易产生核苷酸片段的随机插入、缺失或突变等[4-5]。而利用HDR可实现外源基因或调控序列的精确插入或缺失，是基因组定点整合最为依赖的修复机制[5-6]。

研究表明，通过小分子化合物激活HDR蛋白或抑制NHEJ蛋白可促进DNA的准确修复，其中能显著提高细胞HDR效率的小分子化合物有Scr7、L755507、Brefeldin A、CHIR99021和RS-1等[7-12]。Maruyama等[8]使用Scr7处理后的哺乳动物细胞将小片段整合至4个靶基因的效率提高了19倍，而注射Scr7至小鼠受精卵使定点整合效率提高了2倍以上；Yu等[12]利用高通量药物筛选的策略发现，L755507 (β3肾上腺素受体激动剂)或Brefeldin A(蛋白转动抑制剂)可将GFP片段整合进Nanog基因的效率分别提高3倍和2倍。Lin等[7]通过PD0325901、CHIR99021分别抑制小鼠胚胎干细胞MEK(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase)和GSK3b信号通路，将Neo基因定点整合效率提高约1～5倍；Song等[11]结合CRISPR/Cas9和TALEN技术，利用Rad51蛋白的激活剂RS-1将GFP基因靶向大鼠RLL基因效率提高2～5倍。虽然已经有较多小分子化合物被应用于提高DNA精确修复效率，但这些研究主要集中在人和小鼠，在猪上的研究鲜有报道。由于与人类生理特征具有诸多相似性，猪可以作为良好的人类疾病动物模型，有利于探索疾病的致病机制，开发治疗药物和诊治途径，是人疾病临床前研究的重要环节[6, 13-14]。

因此，本研究利用HDR通路修复关键因子Rad51激活剂RS-1、Wnt信号关键因子GSK-3抑制剂Chir99021和成纤维细胞生长因子受体FGFR1抑制剂PD173074处理猪胎儿成纤维细胞，研究其对PFFs内HR、SSA和ssODN介导的修复途径的影响，为提高猪细胞内DNA精准修复效率打基础。

1 材料与方法

1.1 材料

SSA报告载体、HR报告载体、ssODN报告载体由本实验室保存；PFFs由广东温氏种猪科技有限公司提供；90 nt的单链寡核苷酸ssODN由华大基因合成，序列为5′-ACATGAAGCAGCACG-ACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCT-ACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGG-ACGACGGCAACTACA-3′；Rad51激活剂RS-1、GSK-3抑制剂Chir99021和FGFR1抑制剂PD173074购自Selleck公司。

1.2 方法

1.2.1 小分子化合物处理PFFs的方法 当PFFs培养至细胞汇合度为50%～80%(8×106)时，分别将不同浓度的小分子化合物RS-1、Chir99021和PD173074添加至细胞完全培养基中，细胞继续培养48 h后进行后续试验。其中RS-1浓度分别为25、10、5和1 μmol·L-1；Chir99021浓度分别为5、2、1和0.5 μmol·L-1；PD173074浓度分别为1、0.5、0.25和0.1 μmol·L-1。

1.2.2 PFFs DNA损伤修复因子表达水平的检测 小分子化合物处理PFFs 48 h后抽提总RNA，反转录后对PFFs DNA损伤修复因子cDNA进行实时荧光定量检测：LIG4 (NC_010453.5)、PNKP(NC_010448.4)、NHEJ1 (NC_010457.5)、XRCC5 (NC_010457.5)、XRCC6 (NC_010447.5)和Rad51 (NC_010443.5)的相对表达量。

表1荧光定量PCR引物序列信息

Table1Theprimersequenceofreal-timePCR

基因Gene序列(5′→3′) Sequence产物/bp ProductLIG4FGCCGCTATCGCAGACATTG251RGCCATCATCTCACCATCAAGGPNKPFGGACCGTGGCAGTGAAACAG221RCTCTTCCTCCTCCTCGTGTGGNHEJ1FGCAGTGTTGGTGATGGAAGAC176RTGGCTCCTCTGGCTGGTTCXRCC5FGAGGAAGGCACCGTTGAAG188RGAGAGAGGAATCTGACACTTAGCXRCC6FGCGATGAAGAAGAAGAAGAGGAG225RCATAGAACACCACTGCCAAGAGRad51FCGTTCAACACAGACCACCAG187RGCAAGTCGCAGAAGCATCC

F.上游引物；R.下游引物

F.Forward primer; R.Reverse primer

1.2.3 流式细胞术检测PFFs细胞周期分布 小分子化合物处理PFFs 48 h后，消化细胞，弃上清，用约1 mL预冷PBS洗细胞2次。加入1 mL -20 ℃的70%乙醇，边加边振荡，于4 ℃固定过夜。过夜的细胞250 g离心5 min，弃上清，收集细胞，以1 mL的PBS洗细胞1次，加入1 mL碘化丙啶(propidium iodide，PI)染色液(500 μL PBS含50 μg·mL-1PI，100 μg·mL-1RNase A，0.2% Triton X-100含10 μL的Triton-X 100)，充分振荡，4 ℃避光孵育30 min，用流式细胞仪进行检测。使用Modifit 5.0进行统计分析。

1.2.4 流式细胞术检测PFFs报告载体精准修复效率 当传代后的PFFs汇合度达到50%～80%(8×106)时，参考Thermo fisher的Lipofectamine®LTX & Plus Reagent protocol说明书，每孔分别转染1.5 μg·孔-1Hind Ⅲ限制性内切酶线性化的SSA、HR、ssODN报告载体。转染6 h后按步骤“1.2.1”分别添加小分子化合物至转染的PFFs中，继续培养48 h后用流式细胞术检测细胞荧光数的百分比。

1.2.5 统计学处理 采用SPSS21 软件进行独立样品T-test分析，分别分析每个处理组与对照组的差异水平。数据以“Mean ± SEM”表示，*表示P<0.05， **表示P<0.01。

2 结 果

2.1 小分子化合物对猪PFFs DNA损伤修复因子表达水平的影响

经不同剂量的Chir99021和PD173074处理后，PFFs DNA损伤修复因子LIG4、NHEJ1、XRCC5、XRCC6和Rad51表达水平都显著下调(P<0.05)，而经不同浓度PD173074(0.1～1 μmol·L-1)处理后，PNKP因子表达均上调(P<0.05)。Chir9902处理组仅在0.5 μmol·L-1剂量下，PNKP因子表达上调(P<0.01)。此外，RS-1作为Rad51基因的激活剂，不但没有提高PFFs中Rad51因子的表达，在高剂量时，反而表现出明显的抑制作用(P<0.05)。同时，高剂量的RS-1还显著抑制LIG4、NHEJ1、XRCC5和XRCC6基因的表达(P<0.05)，而对PNKP的表达表现为促进作用(P<0.05)(图1)。

图1 小分子化合物对猪DNA损伤修复因子表达水平的影响Fig.1 The effects of small molecule compounds on porcine DNA repair factors expression

2.2 小分子化合物对猪PFFs细胞周期的影响

PFFs经高剂量的RS-1和PD173074处理后，均显著减少S期的细胞数量(P<0.05)，而对G2期细胞无显著影响(P>0.05)。2μmol·L-1Chir99021可显著将细胞周期阻滞在S期(P<0.05)，减少G2期细胞数量(P<0.05)。

图2 小分子化合物对猪PFFs细胞周期的影响Fig.2 The effects of small molecule compounds on porcine PFFs cell cycle distribution

2.3 小分子化合物对猪PFFs SSA介导的精确修复效率的影响

经3种不同浓度的小分子化合物处理后，仅Chir99021具有提高SSA修复效率的能力，SSA修复效率分别提高了18.4%(2μmol·L-1，P<0.05)和39.5%(5μmol·L-1， P<0.05)。相反，RS-1可显著降低SSA修复效率(P<0.05)，而PD173074对SSA修复方式没有显著影响(P>0.05)(图3)。

2.4 小分子化合物对猪PFFs HR修复效率的影响

本研究结果显示，低剂量RS-1、Chir99021和PD173074具有促进PFFs细胞HR修复的作用(P<0.05)，如：RS-1的5和1μmol·L-1两个水平，Chir99021的2、1和0.5μmol·L-13个水平，PD173074的0.25和0.1μmol·L-1两个水平，其中Chir99021对HR修复效率提高最明显(P<0.05)，最高可达2.1%(0.5μmol·L-1)，与对照组相比，其HR效率提高了169.7% (P<0.05)。然而，高剂量的RS-1、Chir99021和PD173074对HR修复效率改善作用不明显(P>0.05)，没有随剂量增大而提高，表明PFFs细胞中HR修复方式对RS-1、Chir99021和PD173074 3种药物没有剂量依赖性不明显(图4)。

2.5 小分子化合物物对猪PFFs发生ssODN介导的精确修复的影响

本研究利用不同浓度的RS-1、Chir99021和PD173074处理PFFs细胞，分析其对ssODN修复路径效率的影响，结果显示，3种不同浓度小分子化合物对PFFs中ssODN修复效率均没有显著影响(P>0.05)(图5)。

3 讨 论

在细胞周期过程中，NHEJ可以发生在细胞分裂的任何一个时期，而HR主要发生在S和G2期[15-17]。利用这个规律，可以为研究者提供一个提高定点整合效率的方法。2016年，Yang等[18]利用ABT化合物诱导人多能干细胞停滞在S期，随后将2～5kb的序列整合至人基因组5个区域，将定点整合效率提高约3～6倍；而Lin等[19]在人H293T、成纤维细胞和胚胎干细胞中添加能使细胞停滞在G2期的aphidicolin和nocodazole后，显著提高了小片段的同源重组效率，但同时也发现，有些可使细胞停滞在G2期的药物并没有起到显著作用，甚至降低同源重组修复效率。本研究使用的Rad51激活剂RS-1、GSK-3抑制剂Chir99021和FGFR1抑制剂PD173074目前暂没有相关文献报道其对细胞周期有具体的影响[11, 20-21]，本研究发现，RS-1和PD173074处理后，均显著减少S期的细胞数量，而对G2期细胞无影响。高剂量Chir99021可将细胞周期阻滞在S期，减少G2期细胞数量。通过报告SSA载体也表明，Chir99021将细胞阻滞在S期时，显著提高HDR和SSA的修复效率，而RS-1减少S

A. SSA修复的模式图：pCD3.1-GFP载体补充核酸内切酶Hind III线性化后，产生的DSB被同源的200 bp repeat发生单链退火修复时，GFP表达框修复完整，细胞可以检测到绿色荧光信号，否则细胞不产生荧光；B. 流式细胞术检测PFFs发生SSA修复后的荧光信号图；C. 3种小分子化合物处理PFFs后发生SSA修复效率的统计结果(n=3)A.Schematic diagram of the SSA reporter system. The reporter system contained two 200 bp repeats in the same direction fanking the Hind III restriction site of pCD3.1-GFP plasmid. Upon nuclease cleavage, the generated DSB could be repaired by single strand annealing (SSA), directed by the overlapping repeated sequences, otherwise, the GFP expression can’t be detected. B. Fluorescence detection of SSA efficiency in PFFs after transfected with the reporter system by flow cytometry. C. Summary of SSA efficiency in PFFs treated with different concentrations of the 3 small molecule compounds (n=3)图3 猪PFFs中SSA介导的同源重组修复效率检测结果Fig.3 Result of SSA-mediated HDR efficiency in porcine PFFs

期细胞数量表现为显著降低SSA修复效率，而对HDR效率影响不显著，其具体调控机理还有待进一步研究。

靶位点产生DSB后，机体的DNA修复既可通过HR修复路径，也可通过NHEJ路径，两者之间存在竞争关系。因而采取激活HR或抑制NEHJ的策略都可以提高基因组定点整合效率。有研究报道，共转干扰人或小鼠细胞的Ku70/80的shRNA、1.1kb的插入序列和Cas9质粒，使定点整合效率提高4～5倍；Bertolini等[22]通过RNAi敲减Ku70和Xrcc4在HCT116细胞的表达，显著降低了随机整合的效率，同时将插入200bp左右片段的定点整合效率提高3～4倍。此外，Maruyama等[8]使用LIG4的抑制剂Scr7处理哺乳动物细胞，将小片段整合至4个靶基因的效率提高19倍，而注射Scr7至小鼠受精卵使定点整合效率提高2倍以上；随后Chu等[9]发现，Cas9串联表达LIG4的抑制蛋白E1B55K和E4orf6也可将小片段整合效率提高8倍。同时本课题组前期通过干扰猪胎儿成纤维细胞Ku70/80的表达，也显著提高了HR效率[23]。上述研究均表明，抑制NHEJ通路的关键因子可一定程度提高基因组定点整合的效率。本研究中，Chir99021、RS-1和PD173074处理胎儿成纤维细胞后，在一定浓度下都可显著下调NHEJ关键修复因子LIG4、NHEJ1、XRCC5、XRCC6基因表达水平，似乎暗示这些小分子化合物具有提高HR效率的潜力。

A.HR修复的模式图：pCD3.1-deficient GFP载体被核酸内切酶Hind III线性化后，产生的DSB被没有启动子的donor质粒的GFP(同源臂350 bp)进行同源重组修复，GFP表达框修复完整，细胞可以检测到绿色荧光信号，而没有发生同源重组的质粒则没有荧光表达；B. 流式细胞术检测PFFs发生HR效率的荧光信号图；C. 3种小分子化合物处理PFFs后发生HR修复效率的统计结果(n=3)A.Schematic diagram of the HR reporter system: This system consists of a target vector(pCD3.1-deficient GFP) expressing a deficient EGFP, in which a stop codon and a restriction site are introduced, and a donor plasmid containing a promoter-free intact EGFP gene with approximately 350 bp homology arms specific to the target vector. After homologous recombination, the GFP signal can be detected in cells, otherwise, no GFP expression. B. Fluorescence detection of HR efficiency in PFFs after transfected with the reporter system by flow cytometry. C. Summary of HR efficiency in PFFs treated with different concentrations of the three small molecule compounds (n=3)图4 猪PFFs中HR介导的重组修复效率检测结果Fig.4 Result of HR-mediated HDR efficiency in porcine PFFs

通过流式细胞术检测绿色荧光细胞数，结果发现，Chir99021、RS-1和PD173074处理均可提高HDR修复效率，与NHEJ关键修复因子表达水平结果相一致。由于SSA与ssODN修复通路较HDR修复通路更为复杂，其过程中不仅需要HDR通路因子如Ras52等的参与，也需要NHEJ通路因子如LIG3等的参与[24]，所以小分子化合物处理细胞后对SSA修复与ssODN修复效率的影响需要更深入的研究。此外，本研究中,RS-1并没有提高Rad51的表达，但其低浓度却提高HDR效率，这可能与其显著抑制了LIG4、NHEJ1、XRCC5、XRCC6、Rad51基因的表达有关。但作为Rad51的激活剂，RS-1却下调了Rad51的表达，与文献报道不一致，分析这可能与本研究采用细胞的类型或种属有关[11, 25]。Li等[10]研究发现，Scr7在猪上可显著抑制LIG4的表达，提高HR效率，但Song等[11]研究发现，Scr7在兔上并没有显著作用，因此作为人和小鼠Ras51促进剂的RS-1在猪胎儿成纤维细胞可能导致其对Rad51的促进效果并不明显，导致对HR效率存在差异。此外，也有研究表明[26-27]，过表达内源性的Rad51也会导致HR效率的降低，因此其具体调控机理还有待进一步研究。

A. ssODN修复的模式图：在单链长片段ssODN修复下，有DSB的缺陷GFP质粒与左右各45 nt，共90 nt的ssODN发生同源重组，GFP表达框修复完整，细胞可以检测到绿色荧光信号，而没有发生同源重组的质粒则没有荧光表达；B. 流式细胞术检测PFFs发生ssODN效率的荧光信号图；C. 3种小分子化合物处理PFFs后发生ssODN修复效率的统计结果(n=3)A.Schematic diagram of the ssODN repair system: The DSB of defective GFP reconstitutes a functional GFP-coding sequence with the 90 nt single-stranded oligonucleotide (45 nt left and right,respectively), and the GFP signal can be detected in cells, however, without homologous recombination, the GFP can’t be expressed in cells. B. Fluorescence detection of ssODN efficiency in PFFs after transfected with the reporter system by flow cytometry. C. Summary of ssODN-mediated efficiency in PFFs treated with different concentrations of the 3 small molecule compounds (n=3)图5 猪PFFs发生ssODN介导的修复效率检测结果Fig.5 Result of ssODN-mediated repair efficiency in porcine PFFs cells

4 结 论

本研究结果表明，适当浓度小分子化合物的应用有利于不同策略的基因敲入细胞系的产生，为获得精确的遗传修饰动物模型打基础。