兔巴氏杆菌油佐剂疫苗制备与免疫效果分析

刘曼 李明勇 刘照波 张志全 王召朋

（青岛康大食品有限公司 264000）

兔巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌引起的一种人畜共患病，又称兔出血性败血病，临诊特征是鼻炎、地方流行性肺炎、全身性败血症、中耳炎、结膜炎、子宫积脓、睾丸炎等不同病型。特别以季节变化、潮湿、闷热、通风不良、饲养管理不当等各种不良应激容易引起家兔发病和死亡。

2018年5月下旬以来，山东省青岛地区部分兔场在断奶前后出现大量死亡，表现为种兔张口仰脖喘气、流涎，死亡率高，剖检胸腔及心包积液，腺肿大充血，肺严重化脓性坏死，肺脏解剖面散布白色脓包，内含奶油状内容物，肝脏边缘发黑变性。

由于巴氏杆菌病血清型众多，且各血清型之间的交叉免疫保护作用较小，商品疫苗对本地流行菌株的保护效果不理想。因此，本试验利用本地区分离的巴氏杆菌3：A、6：A菌株制备自家灭活苗，观察对兔的免疫效果。

1 材料与方法

1.1 仪器及材料

1.1.1 菌种

兔多杀性巴氏杆菌3：A、6：A菌株 (青岛易邦生物工程有限公司分离鉴定，3：A对家兔的致死剂量为8～10cfu/ml，6：A菌株最小致死量为50cfu/ml)。

1.1.2 试验动物

35日龄清洁级大耳白兔30只 （青岛康大生物科技有限公司提供）。35日龄断奶商品兔2000只 （养殖户提供）。

1.1.3 主要试剂

细菌微量生化反应管、麦康凯琼脂粉、血琼脂平板、营养琼脂、改良马丁培养基等，均购于北京路桥技术股份有限公司；白油由深圳中润通化工有限公司生产；甲醛由国药集团化学试剂有限公司生产。

1.1.4 主要仪器

立式压力蒸汽灭菌购于上海博讯实业有限公司，恒温振荡培养箱购于上海博讯实业有限公司，数显隔水式不锈钢电热恒温培养箱购于上海无锡沃信仪器有限公司；医用型超净工作台购于上海三发科学仪器有限公司。

1.2 巴氏杆菌疫苗悬液的制备

将从病料中分离筛选出的菌株3：A、6：A分别接种于血液琼脂培养基上，37℃培养18h后，分别转接于马丁肉汤培养基中（1.0%血清含，0.1%血红素），37℃振荡培养18～24h，进行纯度检查合格后作为种子液。按照10%的比例将种子液再次接种于马丁肉汤中，37℃振荡培养24h，收集菌液，确保菌含量达到2.5×1010CFU/ml。

1.3 菌液的灭活

在制备好的菌液中加入甲醛溶液，使其终浓度为0.35%，37℃灭活24～48h。将这杯好的灭活菌液接种于血琼脂平板进行无菌试验，37℃培养24～48h，如血琼脂平板无细菌生长，说明菌液已完全灭活。

1.4 疫苗的制备

灭活后菌的液加入2%吐温-80完全溶解。同时按照白油92%、Span-80 6%、硬脂酸铝2%的比例均匀混合油相，高压灭菌后自然冷却至室温。将油相与灭活后的菌液按3：1的比例混合，充分混匀，乳化备用。

1.5 疫苗质量检验

1.5.1 无菌检验

取制备好的疫苗接种于血琼脂平板，检查是否有细菌生长。

鉴于干扰信号产生的原因错综复杂，且具有很大的随机性，单纯的硬件抗干扰措施很难保证信号传输、接收完全不受干扰，因此设计了必要的软件抗干扰措施。

1.5.2 粘度检验

用移液管吸取疫苗1ml，观察自然流出时间。

1.5.3 稳定性检验

采用3000r/min离心15min的离心加速分层法，观察液体分层情况。

1.5.4 疫苗的免疫效果检验

将30只清洁级试验兔随机分成3组，每组10只，第一组皮下接种疫苗0.5ml/只，第2组皮下接种1ml/只；第3组作为对照，不接种。接种14d后，每组试验兔肌肉注射致死量强毒菌液。观察各组的发病率、死亡率及剖检病死兔，观察病理变化。

1.6 疫苗的中试试验

35日龄断奶商品兔2000只，分两组，每组各1000只，试验组皮下接种1ml/只巴氏杆菌疫苗，空白对照不接种。记录70日龄出栏成活率。对死亡兔进行解剖和临床症状的记录。

2 结果与分析

2.1 疫苗质量检验分析

灭活苗接种于血琼脂平板无细菌生长，表明无菌检验合格，灭活效果良好。

附表 灭活苗效率检验结果

2.1.2 粘度检验

用移液管吸取疫苗1ml，自然流出所需时间约5s，符合油佐剂疫苗的粘度要求 (4～6s)。

2.1.3 稳定性检验

将疫苗滴于蒸馏水中，疫苗不扩散，且3000r/min离心15min后无分层，表明疫苗的稳定性良好。

2.1.4 疫苗效力检验

如附表所示为效力检验结果。对照组未接种疫苗，攻毒后全部发病，全部死亡。剖检病死兔，表现为典型的巴氏杆菌病变特征。试验组1，接种0.5ml疫苗，10只兔发病4只，死亡2只，发病率和死亡率分别为40%和20%；试验组2接种1ml疫苗，无发病和死亡，表明注射该疫苗1ml时，免疫效果最好。

2.2 疫苗的中试试验

中试试验结果：对照组未接种疫苗1000只兔，出栏存活775只，死亡225只，出栏成活率77.50%，而接种疫苗的试验组，死亡111只，出栏存活889只，出栏成活率达88.90%。分别对对照组和试验组的病死兔进行剖检和死亡原因分析。试验组死亡111只，呼吸道疾病死亡为11只，占死亡数的9.9%，腹泻发病79只，占死亡数的71%，其他死亡原因的21只，占死亡总数的18.91%。对照组死亡225只，呼吸道疾病死亡108只，占死亡总数的48%，腹泻死亡89只，占死亡总数比例39.55%，其他死亡28只，占死亡总数比例12.44%。数据表明，疫苗对兔群具有一定的保护作用。

3 讨论

本试验利用兔场分离的巴氏杆菌不同血清型的菌株，挑选致病力强的3：A和6：A血清型的菌株制备的兔巴氏杆菌油佐剂灭活疫苗，经无菌试验、安全试验检验合格后，经免疫试验证明疫苗免疫剂量为1ml时，免疫效果最好。中试试验结果表明，该疫苗起到了良好的保护作用，大大提高了商品兔的出栏成活率。对病死兔的死亡原因进行记录和剖检，试验组呼吸道疾病死亡11只，而对照组呼吸道疾病死亡108只，腹泻和其他死亡原因比例相差不大，证明该疫苗对巴氏杆菌病具有一定防治作用。

在对照组的死亡兔中分离到了3：A和6：A血清型的巴氏杆菌，而试验组中未分离到3：A和6：A血清型巴氏杆菌，仅分离到了3：F血清型巴氏杆菌，证明3：A和6：A型自家苗具有良好的免疫效果，对临床的发病具有良好的控制作用。