多模态纳米探针在乳腺癌分子影像与精准治疗中的研究进展△

洛小珺，周纯武

国家癌症中心/国家肿瘤临床医学研究中心/中国医学科学院北京协和医学院肿瘤医院影像诊断科，北京100021

乳腺癌是严重威胁女性生命健康的恶性肿瘤，过去20年，其发病率不断增加[1]。早期乳腺癌无任何症状，通常当患者查体或影像学检查发现明确肿块时，可能已经发生转移。因此，检出未形成结节的乳腺癌对于提高患者预后有重要意义[2]。乳腺癌通常采取综合治疗，可以集外科治疗、放化疗、内分泌治疗、靶向治疗为一体，但是选择方案时应参考肿瘤病理分子分型以指导或预测肿瘤对不同治疗方案的反应性。治疗的同时还要考虑到治疗抵抗与肿瘤复发，因此在治疗过程中应紧密随访临床表现、影像学检查结果，必要时病理学活检取得组织学标志以评估疗效。从病理学角度分析，传统影像学检查难以发现的早期乳腺癌、转移灶及肿瘤治疗后改变已经在基因和细胞水平发生了显著变化[3]。目前，传统治疗使用的大多数药物水溶性差、代谢高，使它们不具有生物相容性，并且导致全身不良反应[4]。乳腺癌药物治疗的另一主要缺点是对肿瘤细胞靶向性不足，导致药物对正常组织也具有杀伤作用，是肿瘤产生耐药性的根源[5]。近年来，纳米粒子（nanoparticle，NP）广泛应用于生物医学领域，被修饰加工成为高效低毒的肿瘤分子影像造影剂或药物递送载体[6]，为解决以上乳腺癌精准诊疗相关问题带来了希望。本文通过回顾近年来多模态纳米探针在乳腺癌方面的研究，阐述纳米探针的概念和机制，列举纳米探针在乳腺癌精准诊疗中的应用，并提供对其发展前景、研究方向和临床应用局限性等方面的见解。

1 纳米探针的概念及原理

纳米探针是将不同材料（如金属、有机物及半导体粒子等）作为平台，制成大小与生物大分子相似的结构[7]。NP表面常常被亲水聚合物聚乙二醇（polyethyleneglycol，PEG）包被或被兼性离子基团官能化，以抵御血清蛋白的吸附[8]。修饰过的NP可以偶联多种分子，包括靶向分子、荧光基团、放射性同位素及治疗药物等。

NP在乳腺癌方面的研究大多处于临床前阶段，主要依靠动物模型。目前特定的细胞株可以提供较常见的临床亚型：Luminal A型（如MCF-7、T47D）、Luminal B型（如BT474、MDA-MB-361），人表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）阳性（如SKB-R3、HCC202）和三阴性（如BT20、MDA-MB-231及MDA-MB-468），但不是所有的细胞株都可以建立动物模型[9]。

NP通过乳腺癌新生血管时发生增强渗透与驻留（enhanced permeability and retention，EPR）效应，从血管孔隙渗出，而肿瘤的淋巴系统不完善，无法及时清除。因此，NP较长时间富集于肿瘤组织，被肿瘤细胞吞噬，当进入溶酶体后，电荷发生逆转，装载物质释放[10]。此外，纳米探针应具备以下条件：①表面具有足够多的官能团以偶联功能性分子；②流体动力学尺寸为10～100 nm，以防止被肝、肾清除；③Zeta电位接近中性，以减少与非靶细胞的非特异性相互作用；④在活体中稳定性高[11]。设计具有特定理化性质（如粒径大小、界面性质及表面修饰等）的NP是实现乳腺癌分子影像和精准靶向治疗的基础。

2 基于NP的乳腺癌显像

2.1 磁共振成像

磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）因其具有较高的空间分辨率而广泛应用于临床。临床应用较多的MRI对比剂是钆喷酸葡胺（Gd-DTPA），钆是高顺磁物质，可以增加T1弛豫率，与不同类型的NP结合可以增加探针聚集区域T1加权像对比度[12]。Turino等[13]在MCF-7乳腺癌动物模型中利用载有钆对比剂的NP进行肿瘤体外监测。超顺磁性氧化铁纳米粒子（superparamagnetic iron oxide，SPION）也是最受欢迎的MRI造影剂之一，SPION的高磁敏感性缩短了T2弛豫时间，在T2加权像上呈低信号，因此，常作为T2对比造影剂。

Kohler等[14]利用自组装单分子层技术使SPION与叶酸受体靶向药甲氨蝶呤（MTX）共价结合，当NP进入溶酶体，酸性环境促使其裂解并释放MTX，以实现MRI实时监测化疗药物的递送。多种乳腺癌标志物如HER2/neu受体[11]、转铁蛋白受体[15]和整合素[16]等也已经作为SPION诊疗乳腺癌的靶点。

2.2 CT成像

NP也可以携带CT造影剂，如钡或碘化物，提高病变CT对比度。部分NP自身也可以作为对比剂，如纳米金，具有更高的X线吸收系数，造影效果约是碘的3倍[17]。

2.3 放射性核素显像

基于NP的放射性核素显像已被多次应用于乳腺癌，对于正电子发射断层显像（positron emission tomography，PET），经常使用的放射性核素有18F、124I和64Cu，对于单光子发射断层显像（single photon emission computerized tomography，SPECT）常用的放射性核素包括99mTc、111In[18]及125I[19-21]。有报道应用配体-受体的活体血流动力学模型来定量评估PET图像肿瘤区域的受体密度[22]。近期，一种19F标记的纳米乳已被美国食品药品监督管理局（food and drug administration，FDA）批准用于临床[23]。

2.4 光学显像

光学显像（optical imaging，OI）通常包括红外、紫外和可见光，有时也将光声成像（photoacoustic imaging，PAI）包括在内。因其侵袭性小，允许重复检测，已经广泛应用于临床前研究。与可见光相比，近红外荧光的组织穿透性好。有研究将组织穿透深度为21 mm的近红外显像用于乳腺癌动物模型保乳术中，以指导肿瘤切除[24]。Chernomordik等[25]发现肿瘤区域荧光程度可以与乳腺癌HER2表达程度相关，并建立了数学模型。但当探针的血流动力学较快时，肿瘤区域的荧光强度与受体表达程度不相关，而主要取决于造影剂的剂量和清除时间。此外，通过注射偶联有不同种类的抗体和荧光染色剂的纳米探针，选择不同频率的激发光，采集不同频率的发射光，可以实现多靶点实时监测[18]。PAI是一种相对新兴的显像方式，纳米探针吸收脉冲激光的能量，被吸收的能量因热弹性膨胀而产生声压波，利用超声波换能器检测，形成声像图。如果使用非脉冲激光激发，则称为热声成像（thermoacoustic imaging，TAI）。近年来有多个以乳腺癌为导向的PAI的研究发表[26-27]。

3 基于NP的乳腺癌治疗

3.1 通过偶联化疗药物

纳米载药系统可以递送多种药物到达乳腺癌组织，常用的细胞毒性化疗药物包括蒽环类、紫杉烷类和环磷酰胺。有研究利用纳米金刚石递送多西环素（DOX）治疗乳腺癌小鼠模型，NP通过受体介导的胞吞作用进入肿瘤细胞，与常规的DOX治疗相比，可以克服药物外排，显著增加细胞凋亡，并降低对正常细胞的毒性[28]。目前紫杉醇（PTX）与白蛋白合成的NP（注射用紫杉醇白蛋白结合型）已经进入转移性乳腺癌Ⅲ期临床试验，入组454例患者中，NP使用组的治疗总反应率明显高于单纯使用紫杉醇组（33%vs 19%，P=0.001），同时不良反应发生率较低[29]。纳米探针除了递送以上常见的化疗药物，也有运载顺铂[30]、雷帕霉素[31]和阿托伐他汀钙[32]等方面的研究。他莫昔芬（TAM）是一种非甾体类抗雌激素药物，可长期用于绝经后雌激素阳性乳腺癌患者的治疗。一种载有TAM的生物可降解纳米探针，静脉注射到荷有MCF-7肿瘤细胞的雌激素阳性乳腺癌动物模型后，可以使TAM的突释期减低一半，能够在随后时间缓慢平稳释放，经检测释放了TAM后的NP对正常细胞的毒性较低[33]。多种靶向药，如血管活性药物伐普肽、作用于整合素的骨桥蛋白、靶向HER2受体的曲妥珠单抗、靶向叶酸受体的叶酸及作用于透明质酸受体或CD44的透明质酸，已经被纳入了纳米载药系统的研究[34]。小干扰RNA（siRNA）是一种合成RNA，靶向细胞质中的mRNA并诱导其降解以达到基因治疗的目的。然而，siRNA在体内血循环时间短并且容易降解。NP介导的siRNA具有EPR效应，血浆清除率降低。因此，NP介导的siRNA在乳腺癌基因治疗中的临床前应用越来越广泛[35]。以上研究表明，传统治疗乳腺癌的药物装载到纳米探针后有着巨大的应用前景。

3.2 NP自身的治疗作用

某些NP利用其独特的理化性质也具有治疗作用。例如，一种由MnO2制成的NP，可以与肿瘤细胞产生的H2O2反应生成氧气，并将肿瘤微环境的pH值从6.7提高到7.2，促进肿瘤细胞凋亡[36]。磁性纳米颗粒能够在交变磁场中产生热量，有研究表明将偶联曲妥珠单抗的氧化铁纳米微粒置于其中能够促进SK-BR-3（HER2阳性）细胞凋亡[37]。免疫治疗是利用宿主自身免疫防御系统治疗肿瘤[38]，某些NP，如硒，具有内在免疫刺激特性，靶向肿瘤微环境并激活局部免疫应答[39]。值得注意的是，刺激免疫的NP静脉注射后很快会被清除，因此给药途径多是口服或吸入。

4 “多模态诊疗”及“诊疗一体化”

用于乳腺癌筛查、诊断、术中引导及疗效评估的临床前及临床显像方法很多，以NP为载体，联合以上成像技术，称为多模态显像（multimodal imaging，MMI）。通常，MMP在乳腺癌的研究中较为常见。Kosaka等[40]用SPION和量子点（quantum dot，QD）合成探针，利用MRI/FI双模态成像系统追踪小鼠体内乳腺癌的全身和早期微小淋巴结转移。

多种药物及治疗方法被批准用于治疗乳腺癌，基于NP的多功能性，协同多种药物和（或）其他治疗方法的技术，称为多模态治疗（multimodal therapy，MMT）。有报道将紫杉醇和吲哚箐绿（ICG）共同连接到纳米探针，紫杉醇对肿瘤细胞产生细胞毒性的同时，外源性近红外激光照射使ICG放热，协同杀伤肿瘤细胞[41]。

“诊疗一体化”利用集影像与治疗于一体的多功能纳米探针，针对目前乳腺癌早期诊断困难、疗效评估及治疗相对滞后等临床问题提供了有效的解决方法，这使个体化精准诊疗向前迈出一大步。放射性核素标记的NP通过连接特异性单克隆抗体，能够有针对性的对肿瘤原发灶及转移灶进行显像和放射治疗[42]。ICG具有良好的荧光成像性能及光热效应，可用于肿瘤的光学成像和光热治疗，实现诊疗一体化，是目前研究常用的纳米探针“诊疗一体化”工具之一[43]，协同化疗药物能进一步增强NP的抗肿瘤效果[44]。

5 三阴性乳腺癌及乳腺癌肿瘤干细胞

2011年早期乳腺癌共识根据特定基因的表达程度，将乳腺癌分为4种分子分型：Luminal A型、Luminal B型、ErbB2+型及Basal-like型。Basal-like型也称三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC），即雌激素受体、孕激素受体以及HER2均阴性，缺乏有效的分子靶点，常规治疗预后差[45]。有研究表明CD44在TNBC细胞中过度表达，透明质酸对CD44有很高的亲和性，可偶联于NP，实现靶向治疗，其生存期较单纯PTX治疗组明显延长[46]。Miller-Kleinhenz等[47]讨论了TNBC细胞的亚型、标志物和潜在受体，针对基于NP的诊疗一体化治疗TNBC进行了综述。肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）是极少数拥有正常干细胞增殖特性的肿瘤细胞，被认为是肿瘤放化疗抵抗和复发的诱因[48]。以往的方法主要是在细胞水平对CSC进行分离、纯化及检测，如流式细胞术，但难以对活体肿瘤干细胞进行追踪。随着多功能纳米探针的出现，使特异性配体靶向CSC的同时，利用药物或者分化诱导剂等杀伤肿瘤干细胞成为可能[49]。总之，纳米探针为靶向治疗TNBC及CSC带来希望。

6 局限性

虽然多模态纳米探针有一定的优势，但尚存在局限性。多模态高分子纳米探针粒径相对较大，影响对靶细胞的穿透能力。多层组装的纳米探针结构复杂，费用昂贵，难以应用于临床。由于制备方法复杂，每一批次纳米探针的粒径、连接的配体和药物分子的数目都有所不同，进而影响药代动力学，引起探针在体内循环、肿瘤靶向性、显像和治疗效果上的显著差异。此外，NP与机体间作用机制仍然缺乏，生物毒性难以预料。

7 小结

纳米医药技术的兴起得益于生物相容性纳米材料的出现。本文围绕纳米材料的多功能性，叙述了纳米探针在乳腺癌精准诊疗方面的应用。尽管相比于传统方法，纳米探针带来了巨大的优势，但大多数报道只局限于临床前阶段，真正进入临床应用仍需进行大量研究。