Treg细胞及其效应因子Foxp3与反复自然流产相关性的Meta分析

赵心煜，徐 佳（新乡医学院三全学院检验与影像学院，河南新乡450052）

反复自然流产（RSA）是指育龄女性连续2次或2次以上在妊娠28周以前、胎儿体重1 000 g以下时，胚胎自动停止发育而流产的现象[1]。RSA发病率随着流产次数增加而增加，据统计，2次流产孕妇RSA发病率为5%，3次流产孕妇RSA发病率则可达到73%[2]。RSA病因复杂，与遗传、感染，及免疫、生殖和内分泌系统异常等多种因素有关，其中免疫因素与RSA发病密切相关[3]。调节性T细胞（Treg细胞）主要是指具有免疫应答负调节作用的CD4+CD8+T细胞，在诱导免疫耐受及抑制自身免疫反应中具有重要作用[4]。部分RSA孕妇外周血Treg细胞数量明显低于比非RSA孕妇，但也可能无差异。因此，本研究利用Meta分析的方法，通过检索国内外RSA与Treg细胞及其效应因子相关性的病例-对照研究，加大研究样本量，以减少因样本量较小或研究水平、方法不同引起的偏倚，从而为RSA病因学研究及诊疗提供循证依据。

1 资料与方法

1.1 文献的纳入与排除标准

1.1.1 研究类型 涉及Treg细胞及其相关因子Foxp3与RSA相关性的病例-对照研究。

1.1.2 研究对象 （1）RSA组：连续发生2次或2次以上自然流产20～45岁中国女性患者（诊断标准：生殖器官无器质性病变，内分泌功能无异常，夫妇染色体显带核型分析正常，男方生育因素未见异常，排除感染因素，未接受相关治疗）。（2）对照组包括正常早孕组和健康非孕组。正常早孕组：与RSA组同期随机抽取的孕周3～12周健康妊娠女性，年龄与RSA组差异无统计学意义（P＞0.05），既往顺利妊娠至少1胎，无自然流产史、死胎、死产史，无生殖系统解剖结构、内分泌、感染、遗传等方面的异常，无自身免疫性疾病。此次妊娠过程中未出现腹痛、阴道流血等先兆流产症状与体征，超声显示胚胎发育正常。健康非孕组：与RSA组同期随机抽取的为己婚、已生育女性，既往顺利妊娠至少1胎，无自然流产史、死胎、死产史，月经周期规律，无生殖系统解剖结构、内分泌、感染、遗传等方面的异常，无自身免疫性疾病。

1.1.3 研究指标 研究对象静脉血Treg细胞数量、Foxp3表达水平。

表1 Treg细胞相关研究文献基本特征

1.1.4 相似文献处理 若出现相似研究报道（如研究对象、研究人员、研究时间、研究类型等相似），纳入纽卡斯尔-渥太华量表（NOS量表）质量评分高、结局数据全面的研究。

1.1.5 排除标准 （1）重复报告的文献；（2）不能获取全文或信息量少的文献；（3）综述或论著类Meta研究文献；（4）基础研究类文献，如细胞培养、动物实验研究等；（5）重要数据报告不清或缺失的文献；（6）NOS量表评分过低（＜5分）的文献。

1.2 检索策略 计算机联合检索CNKI、VIP、Wanfang Data、PubMed、Elsevier、EMbase、Web of Science 电子期刊数据库，关于Treg细胞及Foxp3的病例-对照研究，始末时间为建刊至2016年10月。中文检索式为：（1）（“Treg”或“CD4+CD25+调节性 T 细胞”）与（“反复自然流产”或“原因不明复发性流产”或“流产”）；（2）“Foxp3”与（“反复自然流产”或“原因不明复发性流产”或“流产”）。英文检索式为：（1）（“regulatory T cells”or“Treg”）and（“RSA”or“URSA”or“recurrent spontaneous abortion”or“abortion”）；（2）（“forkhead box P3”or“forkhead/winged-helix family transcriptional repressor p3”or“Foxp3”）and（“RSA”or“URSA”or“recurrent spontaneous abortion”or“abortion”）。

1.3 文献筛选、资料提取与质量评价 由2位研究者独立进行文献筛选，并使用设计好的表格提取资料，若遇分歧，则讨论决定是否纳入，若无法达成一致意见，则请第三者裁决。提取研究的基本资料包括：第一作者、发表杂志、发表时间、平均年龄、例数、研究结果、检测方法。采用NOS量表对检索到的文献进行质量评价，评价内容包括病例选择、基线可比性、暴露因素的测量，共8条，合计9分。

1.4 统计学处理 采用RevMan5.3统计软件对数据进行分析。首先采用RevMan5.3软件中的Q-检验（检验水准为α=0.1）对纳入的文献进行异质性分析，并用I2值评价异质性大小，若I2＜50%，表明异质性较小或异质性可忽略，采用固定效应模型进行分析；若I2＞50%，表明研究间具有较明显异质性或异质性不能忽略，若各研究间有统计学异质性而无临床异质性或无临床意义，采用随机效应模型进行分析。因本Meta分析的研究指标为连续型变量，故以均数差（MD）或标准均数差（SMD）及95%置信区间（95%CI）为效应指标。最后采用漏斗图对纳入的文献进行风险偏倚检验（α=0.05）。

2 结 果

2.1 文献检索结果、纳入研究的基本特征及质量评价 通过检索策略检索到中英文文献共1 646篇，由2名工作人员严格按照文献的纳入和排除标准，经过初筛、精筛、终筛，最终纳入24篇文献，其中Treg细胞相关文献15篇，Foxp3相关文献9篇。纳入研究的基本特征见表1～2。

表2 Foxp3相关研究文献基本特征

2.2 Meta分析结果

2.2.1 RSA组与正常早孕组Treg细胞占CD4+T细胞百分比的比较 共纳入11篇文献[6-14，16-17]，RSA患者459例，正常早孕女性396例。各研究结果之间无统计学异质性（I2=77%，P＜0.05），故采用固定效应模型进行数据合并分析。因各研究间均值差异较大，所以采用SMD为效应值。结果显示，RSA组与正常早孕组相比，Treg细胞占CD4+T细胞百分比明显减低，差异具有统计学意义[SMD=-2.45，95%CI（-2.85，-2.04），P＜0.05]，见图1。

2.2.2 RSA组和健康非孕组Treg细胞占CD4+T细胞百分比的比较 共纳入 10 篇文献[5，8-12，15，17-19]，RSA 患者384例，健康非孕女性325例。各研究结果之间具有统计学异质（I2=97%，P＜0.05），但因无临床异质性，故采用随机效应模型进行数据合并分析。各研究间均值差异较大，所以采用SMD为效应值。结果显示，RSA组与健康非孕组相比，Treg细胞占CD4+T细胞百分比明显减低，差异具有统计学意义[SMD=-2.45，95%CI（-3.65，-1.25），P＜0.05]，见图2。

2.2.3 正常早孕组与健康非孕组Treg细胞占CD4+T细胞百分比的比较 共纳入6篇文献[8-12，17]，正常早孕女性269例，正常非孕女性257例。各研究结果之间具有统计学异质（I2=97%，P＜0.05），但因无临床异质性，故采用随机效应模型进行数据合并分析。各研究间均值差异较大，所以采用SMD为效应值。结果显示，正常早孕组与健康非孕组相比，Treg细胞占CD4+T细胞百分比明显升高，差异具有统计学意义[SMD=0.18，95%CI（-1.06，1.42），P＜0.05]，见图3。

2.2.4 RSA组和正常早孕组Foxp3 mRNA表达水平分析 共纳入 9 篇文献[11，19，20-26]，RSA 患者 343 例，正常早孕女性355例。因检测Foxp3 mRNA表达水平的方法包括RT-PCR和qRT-PCR，为避免方法学异质性影响结果的可靠性，故根据检测方法的不同分为2个亚组（RT-PCR亚组和qRT-PCR亚组）进行Meta分析。亚组分析结果显示，各研究结果之间仍具有明显统计学异质性，但因无临床异质性，故采用随机效应模型进行数据合并分析。因各研究间均值差异较大，所以采用SMD为效应值。分析结果显示，RSA组与正常早孕组相比，Foxp3 mRNA表达水平明显减低，差异具有统计学意义[SMD=-5.52，95%CI（-7.38，-3.65），P＜0.05]，见图4。

图1 RSA组与正常早孕组Treg细胞占CD4+T细胞百分比Meta分析

图2 RSA组与健康非孕组Treg细胞占CD4+T细胞百分比Meta分析

图3 正常早孕组与健康非孕组Treg细胞占CD4+T细胞百分比Meta分析

图4 RSA组和正常早孕组Foxp3 mRNA表达水平Meta分析

2.2.5 敏感性分析及发表偏倚 为保证结果稳定性，逐一剔除每个研究，再对剩下的研究进行Meta分析，检测本研究结果的敏感性。结果显示，剔除任何一项研究前后，效应值SMD未有明显变化。采用漏斗图对各研究指标进行发表偏倚检验，结果显示，漏斗图存在不对称性，说明本研究纳入的文献可能存在发表偏倚，见图5～8。

图5 RSA组与正常早孕组Treg细胞占CD4+T细胞百分比漏斗图

图6 RSA组与健康非孕组Treg细胞占CD4+T细胞百分比漏斗图

图7 正常早孕组与健康非孕组Treg细胞占CD4+T细胞百分比漏斗图

图8 RSA组和正常早孕组Foxp3 mRNA表达分析的漏斗图

3 讨 论

Treg细胞是一种组成性表达的CD4+CD25+T细胞亚群，主要来源于胸腺，在机体中主要发挥免疫抑制作用。Treg细胞数量降低或功能缺陷可引起多种疾病，并且还参与了移植物免疫耐受。妊娠属于一种半同种异体移植，妊娠成功与否取决于母胎之间双向免疫调节的平衡，在这一平衡过程中Treg细胞发挥着至关重要的作用。大量研究表明，正常早孕女性外周血Treg细胞数量较健康非孕女性增高[8-12]，RSA妊娠女性外周血Treg细胞数量明显低于正常早孕女性和健康非孕女性[5-11]，但章雪莲等[12]研究显示，RSA妊娠女性外周血Treg细胞数量与正常早孕女性相比无明显差异（P＞0.05）。因此，RSA妊娠女性外周血Treg细胞数量变化尚缺乏共识。本研究综合多项研究结果，通过加大样本量，减少小样本量对结果的影响，Meta分析结果显示，RSA妊娠女性外周血Treg细胞数量明显低于正常早孕女性和健康非孕女性，正常早孕女性外周血Treg细胞数量明显高于健康非孕女性，进一步证实RSA与Treg细胞数量降低有关，正常妊娠需具备足够数量的Treg细胞。

Foxp3是Treg细胞特异性转录因子，可使外周血CD4+CD25-幼稚细胞向CD4+CD25+Treg细胞转变，对Treg细胞发育和功能维持具有重要作用[17]。本次Meta分析结果显示，RSA妊娠女性外周血Foxp3表达水平明显低于正常早孕女性，提示RSA与Foxp3表达下降有关。结合Treg细胞数量变化特征，可以认为RSA患者外周血Treg细胞数量和功能均发生异常，也正因Treg细胞的异常，导致母体对胎儿的免疫耐受为降低、免疫排斥反应增强，进而引起病理妊娠。

文献异质性分析结果显示，健康非孕组与RSA组、健康早孕组Treg细胞占CD4+T细胞比例比较，其异质性均明显高于RSA组与健康早孕组比较结果，提示在建立Treg细胞占CD4+T细胞百分比诊断RSA参考值时，应以正常早孕者检测结果为基础建立参考值范围，而且两类人群均具有相同的妊娠机体环境，更具可比性。纳入的各文献中，Foxp3 mRNA表达水平具有较大差异，提示此两项指标的水平可能不稳定，调节机制复杂，而在临床检测中应统一方法和标准，并扩大样本量，建立更适合的参考值。

虽然本研究为避免选择性偏倚，进行了方法学评估，异质性分析结果显示各文献间仍存在异质性，这可能导致各研究结果不具可比性。但因各文献间不存在临床异质性，所以采用了随机效应模型对同类研究SMD值进行了合并，对文献异质性进行了控制，保证了结果可靠性。敏感性分析结果显示，逐一剔除各研究，效应值SMD未有明显变化，说明本研究结果稳定性好。但偏倚分析结果表明，各研究间存在发表偏倚，说明现有的研究质量还有待提高，这是本研究的主要局限因素。本研究是国内第一篇关于Treg细胞及其相关因子Foxp3与RSA相关性的Meta分析论文，采用统计学方法将多项研究结果合并分析，保证了结果客观性，并且所有的研究都按照严格的纳入和排除标准筛选，所以本研究结果与实际研究结果较为接近。

综上所述，Treg细胞数量及其相关因子Foxp3表达水平降低与RSA的发生密切相关。已有关于自身免疫性疾病和肿瘤领域Treg免疫治疗的研究报道，若进一步深入研究Treg细胞与RSA发病机制的相关性，可为Treg细胞应用于妊娠免疫治疗提供依据。但在今后的研究中需加大样本量，提高检测方法的精确度，进行高质量的病例-对照研究。