不同浓度酸雨对镉污染下桑树幼苗生物量和生理特性的影响

徐晨阳，毛晓瑜

(浙江农林大学 林业与生物技术学院，浙江 杭州 311300)

近年来，工业“三废”和生活垃圾大量排放到自然界，导致土壤、水体及大气中都存在重金属及其化合物等有害物质，且含量呈增加趋势，这些污染物可通过食物链危害人类健康[1]。镉(Cd)是毒性较强的重金属元素，在土壤中持久度高、活性强，易被植株吸收，Cd的大量积累对植物存在毒害作用[2]，例如影响植物形态生长、光合作用、呼吸作用以及抗氧化酶活性等[3]。

从1982年国家环保相关部门建立全国酸雨监测网以来，华东地区酸雨频率一直呈增大趋势，覆盖面积也呈扩大态势[4]。浙江省位于中国亚热带地区，该区域酸雨危害普遍严重，多低于pH 5.0，并形成了以杭州、金华和宁波为核心的三角形重酸雨区域[5]。酸雨污染日趋严重，对森林生态系统是个巨大的挑战，酸雨不仅会影响植物光合和呼吸作用，还会抑制植物养分的吸收和运输，从而危害植物整个生理代谢过程[6-7]。相对中度、弱酸性酸雨而言，重度酸雨对植物光合系统的抑制更为明显[8]。另外，酸雨的沉降会对土壤生态系统、土壤重金属的化学行为产生显著影响[9]。酸雨会导致已钝化的重金属重新活化并被植物吸收[10]，甚至增加重金属对植物的毒害作用[11]。

桑树(Morusalba)除了传统的栽桑养蚕作用外，其药食用途、新材料用途也在不断被发掘[12]。桑树适应性强、根系发达的特点使其在防沙治沙、水土保持、盐碱地治理等方面的作用日益凸显[13-14]。农桑12号自育成以来，适应性广、成活率高、抗性强，适宜种植于长江流域和黄河中下游各种土壤类型[15]。本文探讨了Cd处理、弱酸性酸雨处理、重度酸雨处理、Cd与不同浓度酸雨复合处理下，农桑12号幼苗气体交换和叶绿素荧光参数的变化。拟解决以下3个问题：1)单独Cd处理对农桑12号光合及荧光参数的影响；2)不同浓度酸雨对农桑12号的生理影响差异；3)Cd处理下，加入不同浓度酸雨处理，对农桑12号Cd耐受性的影响差异。

1 材料与方法

1.1 研究区概况

研究区位于浙江省杭州市临安区浙江农林大学东湖校区果木园试验地温室，地理位置为119°44′E、30°16′N，属中亚热带季风气候区，四季分明，光照充足，具有春多雨、夏湿热、秋气爽、冬干冷的特征。该地区年平均气温16.6 ℃，其中，月均最高温度为7月的29.1 ℃，月均最低温度为1月的4.1 ℃；年降水日约为158 d，年降水量162 8.6 mm，年蒸发量1 450 mm，年无霜期平均237 d，年日照总时长1 825.7 h，土壤为红黄壤[6，16-17]。

1.2 试验材料

农桑12号扦插条由浙江省农业科学院蚕桑研究所提供。于春季选取大小、长短均一的健康枝条进行扦插培养。待生根后移栽至塑料花盆中(土壤为当地红黄壤，花盆直径26 cm，高40 cm)，每盆1 株，放置在温室大棚内，常规管理。缓苗60 d后挑选长势基本一致的植株，随机分成6组，每组20株，总共120株，进行试验。

1.3 试验设置

试验共设置6个处理：对照(CK)，Cd处理(100 mg·kg-1Cd)，弱酸性酸雨处理(pH 5.6，AR5.6)，重度酸雨处理(pH 3.0，AR3.0)，Cd与弱酸性酸雨复合处理(100 mg·kg-1Cd + AR5.6)，Cd与重度酸雨复合处理(100 mg·kg-1Cd + AR3.0)。

试验初期先进行模拟Cd污染土壤处理。于2016年7月，将CdCl2·2.5H2O配制成溶液，每周2次共6次加入到土壤中，使土壤中Cd含量达到约100 mg·kg-1干土。然后进行模拟酸雨处理，配制方法根据浙江省酸性降水的平均离子组成制定，即母液由体积比为8∶1的H2SO4(浓度98%，密度1.84 g·mL-1)与HNO3(浓度68%，密度1.4 g·mL-1)配制。全淋处理前用蒸馏水稀释为pH 5.6和pH 3.0的模拟酸雨溶液，喷洒量根据临安区近10 a各月平均降水量折算后制定，即每周全淋处理2次，每次300 mL，对照组喷淋等量蒸馏水，直至试验结束[6，18]。

1.4 测定方法

1.4.1 生物量测定

试验完成后，将试验桑树整株取回，用蒸馏水洗净后按器官分为根、茎、叶，于105 ℃烘箱中杀青5 min后，置于60 ℃烘干至恒质量，分别称量根干质量(root weight，RW)、茎干质量(stem weight，SW)、叶干质量(leaf weight，LW)，并计算总干物质积累(dry matter accumulation，DMA)。

1.4.2 气体交换测定

每个处理组分别随机选择3株农桑12号幼苗，对第4片完全展开的叶片进行气体交换测定。仪器为便携式光合作用测定系统(LI-6400XT，LI-COR，USA)。参数设置：叶面温度25 ℃，相对湿度60%，流量500 μmol·s-1，入气CO2浓度为大气中CO2的浓度。选择在晴朗上午的09：00～11：00进行测定。测定指标包括净光合速率(net photosynthetic rate，Pn)、蒸腾速率(transpiration rate，E)、气孔导度(stomatal conductance，Gs)、胞间CO2浓度(intercellular CO2concentration，Ci)。

1.4.3 叶绿素荧光参数测定

每个处理组分别随机选择3株农桑12号幼苗进行叶绿素荧光参数的测定。仪器为调制叶绿素荧光成像系统(IMAGINGPAM，WALZ，GERMANY)，测定前叶片暗适应20 min。测定指标包含PSⅡ最大光化学量子产量(maximum photochemical efficiency of PSⅡ，Fv/Fm)、PSⅡ潜在活性(potential activity of PSⅡ，Fv/F0)、PSⅡ光合量子产量[effective quantum yield of PSⅡ，Y(Ⅱ)]、光化学淬灭系数(photochemical quenching，qP)、非光化学淬灭系数(non-photochemical quenching，qN)和通过PSⅡ的电子传递速率(electron transport rate，ETR)等。

1.5 数据处理

利用SPSS 22软件对数据进行方差分析(ANOVA)，Cd与不同浓度酸雨处理之间的交互作用采用多因素方差分析进行处理，比较方法采用LSD检验(P<0.05)，使用Excel 2013绘制图表。

2 结果与分析

2.1 桑树幼苗生物量

由表1可知，Cd处理显著降低了桑树幼苗的RW与SW，与对照相比，RW与SW分别减少了46.9%与24.1%，LW也有所降低，但不显著。AR5.6处理下，桑树幼苗的RW显著降低，下降比例为31.5%；而AR3.0处理引起了RW与SW的显著降低，下降比例为27.6%与28.6%。

在Cd污染前提下，弱酸性酸雨的加入显著降低了桑树幼苗RW。与Cd处理相比，Cd+AR5.6处理使得RW下降了14.0%，而重度酸雨的加入显著降低了桑树幼苗的RW与LW，下降比例为13.3%与26.8%。

与对照相比，各处理均引起了桑树幼苗DMA的显著降低，Cd处理、AR5.6处理、AR3.0处理、Cd+AR5.6处理、Cd+AR3.0处理分别降低了30.0%、9.8%、24.7%、27.1%、26.9%。结合图1可知，各处理改变了桑树幼苗生物量的分配，与对照相比，各处理均降低了RW分配；除AR3.0降低了植株SW分配外，其余各处理均促进了SW分配；除Cd+AR3.0处理降低了植株LW分配外，其余各处理均促进了LW分配。由此可知，各处理下桑树幼苗DMA的显著降低主要源于RW受到的抑制。

表1 AR5.6、AR3.0对Cd污染下农桑12号幼苗生物量积累的影响

同列数据后无相同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05)。下同。

Data marked without the same lowercase letter in each column indicated significant differences atP<0.05 according to LSD test.The same as bellow.

2.2 桑树幼苗气体交换参数

非生物限制因素条件下，光合作用是反映植株生长和代谢状态的重要指标[19]，而光合特性主要通过Pn、E、Ci和Gs等来反映[20]。由图2可知，与对照相比，Cd处理显著降低了桑树幼苗的各气体交换参数数值，Pn、E、Ci和Gs分别下降了32.4%、47.5%、14.9%、48.0%。AR5.6与AR3.0处理均显著降低了Pn、E和Gs，AR5.6处理对于以上3个指标的影响要远小于AR3.0处理，AR5.6处理下，Pn、E和Gs分别下降了12.2%、16.9%和22.1%，而AR3.0处理下分别下降了30.1%、58.0%和48.2%。

图1 AR5.6、AR3.0对Cd污染下农桑12号幼苗生物量分配的影响Fig.1 Effect of AR5.6 or AR3.0 on biomass allocation of Nongsang12 exposed to Cd pollution

在Cd污染前提下，弱酸性酸雨的加入显著缓解了Pn、E、Ci和Gs等指标，与Cd处理相比，Cd+AR5.6处理使得Pn、E、Ci和Gs分别上升了18.7%、42.0%、17.7%和44.3%，而重度酸雨的加入对以上指标并没有缓解作用，甚至显著降低了桑树幼苗的E和Gs，Cd+AR3.0处理下的E值仅为Cd处理时的一半，Gs也仅是Cd处理时的3/4。

对Cd与不同浓度酸雨处理之间的交互作用分析可知，Cd与AR5.6交互处理对农桑12号幼苗的Pn与Ci存在显著影响，对Gs和E存在极显著影响；Cd与AR3.0交互处理对农桑12号幼苗Ci影响不显著，对Pn、Gs、E影响极显著。

2.3 对桑树幼苗叶绿素荧光参数的影响

作为光合作用的探针，叶绿素荧光参数反映了植物受伤害的程度[21]。由图3可知，与对照相比，Cd处理显著降低了桑树幼苗的Fv/Fm、Fv/F0和ETR，分别下降了4.9%、18.7%和12.0%。AR5.6处理对桑树幼苗叶绿素荧光参数的所有指标均无显著影响。AR3.0处理显著降低了桑树幼苗的Fv/F0，与对照相比，降低了9.6%。不同浓度酸雨处理对桑树幼苗Fv/Fm和Fv/F0的影响存在显著差异，与AR5.6相比，AR3.0处理下桑树幼苗的Fv/Fm和Fv/F0分别降低了3.0%和13.1%。

在Cd污染前提下，弱酸性酸雨的加入没有加剧或缓解Cd对桑树幼苗光系统Ⅱ的毒害作用。

Pn、Gs、Ci和E分别表示净光合速率、气孔导度、胞间CO2浓度、蒸腾速率。ns、*、**分别表示P>0.05，0.010.05，0.01

而重度酸雨的加入显著降低了Fv/Fm和Fv/F0，与Cd处理相比，Cd+AR3.0使Fv/Fm和Fv/F0分别降低了6.9%和19.2%。

对Cd与不同浓度酸雨处理之间的交互作用分析可知，仅Cd与AR3.0的交互作用对Fv/Fm存在显著影响。

3 讨论

植物在受到重金属胁迫时，会表现出根部生长受限的现象[22-23]，而不同浓度酸雨的全淋处理会引起植物生物量分配的差异[18]。本试验中，生物量积累的降低说明各处理均抑制了农桑12号幼苗的生长，但不同处理间存在生物量分配差异，说明各胁迫条件对植株根系与地上部分的生长有不同影响。弱酸性酸雨处理抑制了植株地下部分生长，促进了地上部分生长，这可能是酸雨中的氮素为植物地上部分合成蛋白质提供了充足的氮源，光合产物更多地分配在茎叶，从而降低了地下部分生物量的积累。重度酸雨处理对地上地下部分生长均存在抑制，这可能是因为重度酸雨直接作用于叶片后破坏了叶片膜结构，降低了叶绿素含量与叶片酶活性[18]，引起植株光合能力下降，从而导致了植株整体生长受到抑制。Cd处理对根部生物量的抑制作用强于其他器官，这是由于模拟Cd污染土壤处理首先影响的就是植株根系，弱酸性酸雨的加入降低了根部生物量所占的比例，这可能是弱酸性酸雨缓解了Cd对植株地上部分的毒害，而重度酸雨的加入加剧了植株叶片受到的伤害，这可能是Cd与重度酸雨的复合作用，也可能是重度酸雨的加入增大了Cd在根茎叶之间的转运量[24-25]，这还需要对各器官Cd元素的积累进行研究。

图3 AR5.6、AR3.0对Cd污染下农桑12号幼苗叶绿素荧光参数的影响Fig.3 Effect of AR5.6 or AR3.0 on chlorophy Ⅱ fluorescence parameters of Nongsang12 exposed to Cd pollution

重金属胁迫除了会抑制植物卡尔文循环酶活性，从而直接影响植物的光合功能以外[26]，也会导致叶片气孔关闭而间接影响光合作用[27]，Ci值的变化与否是判断植株光合作用是否为气孔限制的依据[28]。在本试验中，农桑12号幼苗在Cd处理与Cd+AR3.0处理下，都表现为Pn、E、Gs、Ci的显著降低，可以推断，气孔因素是抑制这2种处理下植株光合作用的原因之一，即Gs降低，导致了光合作用所需CO2供应不足从而抑制了Pn。而AR5.6、AR3.0与Cd+AR5.6处理下，Ci值并没有显著降低，说明这3种处理下Pn的降低不是由于CO2的缺乏导致的，但Ci也没有显著升高，说明CO2没有在叶肉细胞间大量积累，所以也不能推断是非气孔因素令CO2的利用受阻导致Pn的降低，这可能是酸雨影响了叶肉细胞的酶活性或是导致了细胞的膜脂过氧化等[14]，这还需要进一步的研究。

E受到气孔开闭的影响，气孔开放时E增大，气孔关闭时E减小[29]。本试验中，与对照相比，各处理下E与Pn均同步下降，同时，Gs与E也同步下降，说明可能是气孔保卫细胞失水，即水分因子导致的农桑12号幼苗Gs的降低，也可能是各处理导致叶片脱落酸水平增加而导致气孔关闭[30]。

由气体交换参数可知，单独的AR处理下，随AR浓度的增大，对光合系统的抑制作用增大，其他关于不同浓度酸雨的研究也支持以上结果[6，18]。Cd处理抑制了农桑12号幼苗叶片的碳同化能力，弱酸性酸雨溶液的加入，缓解了Cd的毒害作用，这可能由于酸雨中含有的N、S对叶片生长有促进作用，对植株起到了补充N源的效果；而重度酸雨溶液的加入，进一步降低了植株的光合作用水平，这可能是Cd与AR3.0的交互作用，也可能是重度酸雨溶液降低了植株的Cd耐受性。

作为PSⅡ的最大光化学量子产量，Fv/Fm能反映PSⅡ反应中心的光能转化效率，Fv/F0能反映PSⅡ捕获激发能的效率[31]。本试验中，Cd处理下桑树幼苗的Fv/Fm和Fv/F0均显著降低，说明Cd污染对PSⅡ的远处光化学效率和从天线色素到PSⅡ反应中心的传能效率都造成了影响，并出现了光抑制现象[32]；同时，Cd处理对Fv/F0造成的影响程度高于Fv/Fm，从而可以推断Cd处理对桑树幼苗传能效率的抑制比对其光能转化效率的抑制更为明显。与此同时，与AR5.6相比，AR3.0处理显著降低了Fv/Fm和Fv/F0，说明AR3.0对植株光合电子传递和传能效率的抑制均显著高于AR5.6。另外，与AR5.6相比，AR3.0处理下，Fv/F0的下降程度大于Fv/Fm，说明酸雨浓度的增大对植株造成的破坏更多地体现在对传能效率的抑制方面。

qP代表PSⅡ反应中心的开放程度，qN代表植物热耗散的程度，Y(Ⅱ)反映的是PSⅡ光合量子产量，ETR反映了电子传递速率[33-35]。本试验中，与对照相比，各处理下qP均无显著变化，说明Cd与不同浓度酸雨处理均没有降低PSⅡ原初电子受体重新氧化的能力，氧化状态仍处于正常水平，但Cd、Cd+AR5.6、Cd+AR3.0处理下ETR均显著降低，说明由于PSⅡ电子传递速率的降低导致了原初电子受体不能高效率地向后传递，电子传递过程受阻，最后导致了Y(Ⅱ)的降低。Cd、Cd+AR5.6、Cd+AR3.0处理中，qN均有不同程度的升高，说明PSⅡ吸收的光能已经过剩，而植株只能以较高的热耗散方式来保护光合系统。处理间对比而言，AR3.0处理与AR5.6处理相比，只是对电子传递速率造成了少许抑制，并不存在显著差别；另外，复合处理下，与Cd处理相比，AR5.6的加入并没有像缓解植株气体交换速率那样缓解植株电子传递速率受抑制的程度，而AR3.0的加入显著阻碍了电子传递过程，从而导致Y(Ⅱ)的进一步降低，且qN较Cd处理时有所上升，说明AR3.0的加入增大了PSⅡ的受损程度，植株只能加强热耗散以耗散过剩光能。

本研究通过模拟不同浓度的酸雨溶液，研究了Cd污染前提下，不同浓度酸雨对农桑12号幼苗生物量积累、气体交换、叶绿素荧光参数的影响，发现Cd污染抑制了农桑12号幼苗的生长，改变了植株生物量分配比例，对植株光合作用有显著的抑制，植株光系统Ⅱ也受到了破坏；同为全淋处理模式下，重度酸雨处理增大了根冠比，而弱酸性酸雨处理降低了根冠比，且重度酸雨对植株光系统Ⅱ的破坏显著高于弱酸性酸雨处理；弱酸性酸雨溶液的加入一定程度上恢复了受Cd胁迫的农桑12号幼苗的气体交换速率以及叶绿素荧光参数，而重度酸雨溶液加剧了Cd对植株光合系统的破坏。