诱导多能干细胞诱导与应用前景

李奥哲

【摘 要】诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells， iPSCs）于2006年被Yamanaka等人发现后，一度成为研究热点。由于iPSC细胞具有类似于胚胎干细胞的增殖潜力与分化能力，且能够通过重编程体细胞来获得，因而相比于胚胎干细胞具有极大的应用潜力与优势。此外，在临床治疗中，诱导多能干细胞能够完成多种细胞类型的分化，甚至可以再生组织器官，因而对于目前较难治愈的某些器官病变疾病有显著的疗效。本文将从诱导多能干细胞概述、分子机制、诱导手段、成果应用以及目前遇到的困难进行简要介绍。

【关键词】 iPSCs；分子机制；重编程；细胞治疗

【中图分类号】R181.3+2 【文献标志码】A 【文章编号】1005-0019（2018）17-291-01

1 iPS细胞概述

体细胞可以重新编程到多能状态下的发现使干细胞研究的前景发生了深刻的改变。这种可以分化的细胞可以通过将核的内容信息转移到卵母细胞或与胚胎干细胞融合而重新编程到胚胎状态从而实现多潜能，让普通体细胞“初始化”，使其具备再造干细胞功能，这就是“iPS细胞”。“iPS细胞”具有和胚胎干细胞类似的功能，这种重新编程的原理不仅避免了使用胚胎收集和培养ESCs的必要性，而且还带来了避免移植排斥和移植物抗宿主病等免疫问题的额外预期优势。因为最初的实验证明小鼠和人类（成纤维细胞可以被重新编程通过病毒特异性过表达成为诱导多能干细胞（iPSCs）转录因子，许多方法已经被发展来产生iPSCs。这些方法可提高重编程细胞的效率和产生无足迹的iPSC，它们是没有整合任何病毒载体序列基因组，然后通过将基因组进行分析和探索得出目的。下文将回顾iPSC信号通路和重新编程方法的当前状态，集中于关注人类细胞的重新编程的各种措施，也会相应的提到对于小鼠细胞和其他更多的重新编程的方法手段。

2 iPS细胞分子机制

获得iPS细胞中最重要的步骤就是体细胞重编程，其中牵涉到的遗传因子有上文提到的Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc以外，还有Nanog、Lin28等。在Takahashi和Yamanaka的研究中已经证明了重编程过程中可以不需要Nanog、Lin28。虽然Nanog对于维持胚胎干细胞多能性并不是不可或缺的，但因其能够阻碍分化，所以仍是重编程过程中的一个重要因子（ 。在同样的研究中，Silva等人发现Nanog能够作为一个分子开关从而调控哺乳动物细胞中一些多能性源序列表达[1]。至于c-Myc因子则不同于以上提到的所有因子，由于它在重编程的最后步骤中不回上调多能性基因网络的表达，因而它也不是必需的。c-Myc主要作用在于提高重编程过程的效率与动力学速率。而在后续的研究中发现Oct4作为核心转录调节回路最后一个因子也是重编程中最重要的因子（Walia， Satija et al. 2012）。但同样有研究表明，一种叫做肝脏受体同系物-1（LRH-1）可以取代Oct4，并且能够提高重编程的效率（Heng， Feng et al. 2010）。

关于iPS细胞中信号通路的研究目前证明有以下四种：Wnt通路，TGF-β通路，p53通路与BMP通路。下面我们通路来分别进行简要介绍前三种通路。

Wnt通路中发现被称为BIO的糖原合成激酶-3抑制因子作为Wnt通路下游效应因子能够维持人类和小鼠胚胎干细胞的多能性（Sato， Meijer et al. 2004）。而另一种GSK3抑制剂CHIR999021则证明能够弥补人类iPS细胞中Sox2缺失的情况。根据以上的研究推测，Wnt通路可以通过产生GSK3抑制因子来维持干细胞特性。其他研究则发现Oct4与Wnt/β-链蛋白通路能够联合作用从而调节Wnt信号来维持干细胞特性并决定细胞命运。

TGF-β通路在目前是研究的热点、重点，研究发现TGF-β主要在维持干细胞多能状态中起到重要作用。TGF-β/激活素通路能够促进人类胚胎干细胞的增殖与自我更新。前文提到的Nanog因子更是TGF-β/激活素通路的直接调节目标，其中的具体调节机制已经证明是Smad共激活因子与Nanog近端启动子结合，从而使得Nanog表达上调。虽然也有研究发现使用TGF-β受体/Alk5激酶抑制剂抑制TGF-β通路之后反而增强了小鼠iPS细胞重编程的效率，并且该抑制剂也能够替代Sox2和c-Myc因子。但是在人类iPS细胞中并没有发现同样的结论。可以看出抑制TGF-β通路所产生的效应较为复杂，并且相关研究并不能得出统一结论，所以还有待进一步研究证明该通路作用机理与明确作用效果。

p53作为研究最深入的抑癌因子之一，在调节体细胞重编程过程中有着重要的保护作用。p53-p21通路除了在肿瘤形成过程中有阻碍作用，在iPS细胞生成中同样有着抑制过度增殖的保护作用。另有研究表明大多数没有敲除p53的细胞能够通過重编程成为iPS细胞或者成为永生性细胞（Hanna， Saha et al. 2009）。而单细胞水平检测发现敲低p53之后的大部分细胞脱离重编程路径，最终整体重编程效率较低。因而有研究认为未来效率更高的重编程应该着重选择p53略低且增殖能力更强的细胞，而不能完全沉默p53通路。

3 iPS细胞诱导手段

3.1 尝试诱导小鼠的IPSC Takahashi和Yamanaka研究表明，完全表达已定义的转录因子也能将细胞（或细胞核）转化为多能状态。在ESCs中维持多能性的因素可能在体细胞中诱导多能性。为了探明因素的作用，他们测试了24个转录因子在mESC中的重要作用。他们通过逆转录病毒转导将这些基因的组合导入小鼠成纤维细胞。这些细胞携带了一种耐抗生素基因，这种基因由β-半乳糖苷酶与新霉素的融合蛋白组成，它只有在F-box蛋白15基因（Fboxo15）被激活时才会表达，在表达后使用G418对融合蛋白进行筛选。他们设计了这个实验，通过逐步排查，最后他们发现只有四种因素足以产生类似于ESC的菌落。基因组合为Oct3/4，Sox2， Klf4， c-Myc。这些重编程细胞被命名为诱导多能干细胞（iPSCs）。

3.2 Cre-Lox转基因敲除介导的单个盒式重编程载体 由于慢病毒能够感染不分裂和增殖的细胞，因而它成为体细胞表达重编程因子更好的运载体。但是这种方法有两种弊端，一是其效率达不到使用要求，二是存在慢病毒的载体可能整合进入iPS细胞的基因组中的风险。为解决这些弊端，研究采用开发一种单个盒式重编程载体，并在其中每个重编程因子能够彼此分开[2]，以自切肽信号的形式分布到每个载体中。这些载体中一部分就是构建LoxP位点，以此通过Cre重组酶的过表达来切断任何连续整合的序列。

3.3 非病毒重编程方法

3.3.1 mRNA转染 通过转染mRNA的方式使受体细胞表达重编程因子同样是一种无足迹制备iPS细胞的方法。有研究通过此方法在转染20天内人成纤维细胞重编程效率达到1.4%（Warren， Manos et al. 2010）。在此基础上，将Lin28因子、丙戊酸加入到Yamanaka重编程方案中，在O2下培养，重编程效率可以提高到4.4%。尽管重编程因子的mRNA能够买到，且效率较高，但目前除成纤维细胞以外并没有成功的案例。

3.3.2 miRNA感染/转染 在胚胎干细胞中有几个miRNA簇得到强烈表达。当miR-302b和miR-372加上四种慢病毒Yamanaka因子合成模拟物添加到MRC5和BJ-1成纤维细胞后重编程效率比只加入四种慢病毒因子提高10-15倍（Subramanyam， Lamouille et al. 2011）。而某些miRNA同样能够在没有Yamanaka因子时仍旧能维持高效重编程人类细胞。只使用miR302/367的种子序列在转染12-14天后仍大约有10%的BJ-1成纤维细胞产生iPSC（Anokye-Danso， Trivedi et al. 2011）。

3.4 卵母细胞重编程 体细胞基因组通过转移进去核卵母细胞中能够迅速得到重编程，作为iPS细胞的一种替代技术。这种技术在包括小鼠在内的数种物种中效率几乎是100%。然而，限于伦理与部分技术原因，这项技术在人类中并没有得到很好的实施。有研究通过成纤维细胞核转移到未去除细胞核的卵母细胞中进行重编程从而得到了目的细胞。这种方法得到的重编程细胞与iPS细胞的表达谱与表观遗传学标记都十分相似。由于重编程的细胞是三倍体，所以不能用于临床治疗，只能用于科学研究，也因此得以进行。目前该方法受限于伦理难以开展，所以仍需进行技术改进，寻找符合伦理道德的类卵母细胞载体。

4 iPS细胞的应用

科学研究方面，iPS细胞能够作为研究发育中特定时期的特定分子机制研究提供实验材料，在不违背伦理道德的基础上开展更深层次的发源发育研究。同时也能够为研究病理机制、药物作用等临床研究提供基本的实验基础，为临床科研的发展做出巨大的推动。

临床应用方面，iPS细胞能够在特定条件下培养形成拟胚体（EB）结构，并可以在EB结构的基础上通过不同因子诱导分化形成不同类型的功能性细胞，例如造血干细胞（Raya， Rodriguez-Piza et al. 2009）、胰岛B细胞（Maehr， Chen et al. 2009）、运动神经元（Dimos， Rodolfa et al. 2008）等。iPS细胞的主要应用方式有两种，一方面通过诱导形成正常细胞、组织从而替代病变损伤的细胞、组织，达到治愈目的，另一方面通过诱导形成的正常功能细胞，分泌相应物质，如黑色素等，治疗相应疾病。

这种治疗手段是细胞治疗中极具前景的方法之一，既不受限于伦理、道德、法律，又可以避免免疫排斥等问题，而且能够治疗很多目前医疗手段无法治愈的遗传疾病、神经系统疾病等疑难杂症。

5 iPS细胞应用中的困难

iPS 细胞的出现不仅仅因为它能避免人体胚胎克隆技术引发的伦理争议，更由于它突破了以往只能利用卵子和胚胎的取材限制，其高效、便利为再生医学应用打开了大门，为未来干细胞用于个体治疗带来了希望，其应用价值十分令人期待， 但在应用于人体细胞移植或药物研究领域还面临很多问题有待解决。

5.1 致癌风险 这是制約 iPS 细胞在多个医疗应用的首要因素.在培育iPS细胞时，需要依靠逆转录酶病毒或慢病毒将这4个（Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4）基因导入体细胞，而使用病毒载体有可能引发肿瘤形成，因其利用病毒诱导得到的 iPS 细胞基因组中整合了用于重编程的基因， 并能在之后的分化过程中稳定存在， 增加了患癌的风险。此外，每次实验前都要制作新的病毒载体，对操作过程时间的把控和实验室的管理要求严格。因此， 需要在提高安全性的同时， 同时还要高效地获得临床级别的患者特异性 iPS细胞，这些问题的难度都阻碍着iPS细胞技术的普及与在医学上的应用。

5.2 转化机制的未知性 iPS 细胞的再分化机制还不明确， 人类仍不能按照自己的意愿将其定向分化为所需的细胞.正因如此，我们需去更深入的探索如何确保分化后的功能细胞移植后能稳定地发挥功效而不会违反意愿产生了不必要甚至具有危害作用的副作用。通过对其机制的充分研究明确清楚对于iPSCs 和成体细胞之间转变的机制， 以及重编程过程又是如何发生的。因此， 需要进一步深入研究 iPS 细胞定向分化的分子机理，从机制入手解决各类实际问题。

5.3 iPS细胞产生速率缓慢且功能效率低 通过提高 iPS 细胞的分化效率， 从而高效地获得所需的功能性细胞，这是目前对于iPS细胞去投入实际应用的一大具体的问题，在研究过程中发现一些手段我们可以提高速率，但是要进入实际不仅是运用药剂成本的高低问题，还包括了脱离实验室后能否切实的产生预期的目的，这都是需要时间与物力人力的检验。再当发现能够解决这个问题的方法之后我们才能进入理论上对于iPS细胞的预期实践，而使iPS细胞在现代医学存在一席之地。

以上都证明iPS细胞的应用方面还存在很多的疑惑与困难，相信在未来随着研究水平不断提高，相关领域的深度、广度不断增加，相关临床实验的不断开展，人们终有一天能够享受到诱导多能干细胞为健康生活创造的巨大福利。

参考文献

[1] 夏朦， 侯伟健， 柏树令，等. 诱导多能干细胞的研究进展[J]. 中国民康医学， 2015， 26（14）：165-169.

[2] 刘国强， 洪天配. 诱导性多潜能干细胞的研究进展和应用前景[J]. 世界华人消化杂志， 2008， 16（12）：1255-1259.