中高温大曲存储后的感官质量研究

董大伟，王晓慧，苏 葛，马 伟，杨建梅，叶 红

（江苏洋河酒厂股份有限公司，江苏宿迁223800）

大曲通过自然接种和发酵，富集了大量有益于酿酒的微生物、各种酶类以及香味物质，在酿酒过程中起到驱动糖化、发酵和生香的重要作用。也正是如此，才有了俗语“曲为酒之骨”“曲定酒型”之说。为了确保和提升原酒品质，各酒企都制订了相应的大曲质量控制标准，但都仅限于出房曲。大曲在用于酿酒生产前，必须经过3～6个月的存储，减少乳酸菌、乙酸菌等产酸细菌的数量，使入池酒醅能够符合前缓、中挺、后缓落的发酵工艺要求，达到增加酒体绵柔感的目的[1-2]，可见大曲存储后的质量对酿酒影响更为直接。

大曲在存储过程中受存储条件的影响，会出现断面发暗、霉变、裂缝、脱壳以及理化指标波动等现象，还有可能对酿酒以及大曲自身质量带来影响，多数酒企都无相应标准对此进行科学管理和控制。现用曲（为方便阅读，以下将存储后的大曲称为现用曲）的感官表象与出房曲相比有较大不同，如：断面多数呈暗灰色、黑褐色，易出现裂缝、脱壳、霉变，虫害严重等。为了对这些表象进行科学评价，达到全面管控的目的，本文以江苏洋河酒厂的中高温大曲为对象，利用高通量测序技术对现用曲感官质量进行研究和评价。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大曲样品：不同表象的洋河中高温现用曲。

5 g 1#断面样品：取自断面呈灰白色、泡气性较好的曲块的断面部分。

5 g 2#断面样品：取自断面呈暗灰色、浅褐色、欠泡气的曲块的断面部分。

5 g 3#断面样品：取自断面呈黑褐色、有生心、窝水的曲块的断面部分。

5 g 4#裂缝样品：取自干裂曲块的裂缝部分。

5 g 5#曲壳样品：取自大曲样品的曲壳部分。

1.2 实验仪器

Miseq PE300平台、美国ABI GeneAmp®9700型PCR仪。

1.3 实验方法

1.3.1 DNA提取

将1.1中1#～5#样品分别进行DNA提取，将样品粉碎后加入到含SDS（十二烷基硫酸钠）和蛋白酶K的溶液中消化分解蛋白质,再用酚和氯仿/异戊醇抽提分离蛋白质,得到的DNA溶液经乙醇沉淀使DNA从溶液中析出。

1.3.2 基因组DNA抽提

待基因组DNA抽提完成后，使用1%琼脂糖凝胶电泳检测抽提和收集的基因组DNA。

1.3.3 PCR扩增

按指定测序区域，合成带有barcode的特异引物。随机抽取样本进行预实验，以确保在较低循环数中能够将绝大多数样本扩增出适宜浓度的产物。

PCR采用TransGen AP221-02：TransStart Fastpfu DNA Polymerase；每个样本3个平行样，用2%琼脂糖凝胶电泳检测混合后的PCR产物，使用Axy-PrepDNA凝胶回收试剂盒（AXYGEN公司）切胶回收PCR产物，Tris_HCl洗脱；2%琼脂糖电泳检测。

1.3.4 荧光定量

根据电泳的定量结果，使用QuantiFluor™-ST蓝色荧光定量系统对PCR产物进行检测定量，之后根据样本的测序量要求进行相应比例的混合。

1.3.5 Miseq文库构建

连接“Y”字形接头，使用磁珠筛选去除接头自连片段，利用PCR扩增进行文库模板的富集，氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。

1.3.6 Miseq测序

(1)DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上。

(2)另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”。

(3)PCR扩增，产生DNA簇。

(4)DNA扩增子线性化成为单链。

(5)加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基。

(6)用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类。

(7)将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3'端黏性，继续聚合第二个核苷酸。

(8)统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。

1.3.7 生物信息分析

Miseq测序得到的PE reads首先根据overlap关系进行拼接，同时对序列质量进行质量控制和过滤，区分样本后进行OTU聚类分析和物种分类学分析。基于OTU聚类分析结果，进行多种多样性指数分析，以及对测序深度进行检测；基于分类学信息，在各个分类水平上进行群落结构的统计。综合分析可以进行一系列群落结构和系统发育等深入的统计学和可视化分析。

2 结果与分析

2.1 现用曲香味的分析

现用曲粉碎后与酒醅混匀入池发酵，经过发酵和蒸馏后，曲自身的香味会带入酒体，与酒体中的其他香味物质结合，形成了白酒中绵厚怡人的复合香气。所以，大曲的曲香味也是衡量大曲感官质量的重要指标。现用曲与出房曲相比，曲香味有着明显的差别。刚出房的大曲香气浓郁，但香味较杂，混有粮食味；经过一段时间的存储通风排潮后，现用曲中的杂味逐渐消失，曲香更加纯正、浓郁。但受霉变和虫害影响，有的曲块可能存在霉味、馊味和虫屎味等。现用曲存在这些现象是由于储存管理不当，未做好通风排潮工作导致。所以现用曲香味指标的评价应增加对以上异杂味的管控。我们根据分析形成表1现用曲香味评价标准。

表1 现用曲香味评价标准

2.2 现用曲断面的分析

将1.1中1#、2#、3#断面样品按照1.3方法进行高通量测序，并对分析报告中的细菌和真菌群落结构组分（图1、图2）进行分析。断面群落相对丰度情况见表2、表3。

图1 断面群落结构组分图（细菌）

由表2可知，3个样品的细菌群落结构差别较大，1#断面样品有益细菌占比最高，约93%，包括高温放线菌属、魏斯氏菌属、乳酸杆菌属、芽孢杆菌属、（乳酸）片球菌属、糖多孢菌属、克罗彭斯特菌属等，其中高温放线菌属占比约78%，能够起到脱臭生香的作用[3]，优势菌种明显，反映出断面呈灰白色、泡气性较好的曲块不仅糖化发酵作用强，同时也具备较优的生香等功能；2#断面样品有益细菌仅占约35.4%；3#断面样品优势菌种不明显，其中乳酸菌类偏多，且杂菌种类较多，包括葡萄球菌属、肠杆菌属、肠道菌属、蓝细菌属等。断面呈暗灰色、浅褐色、欠泡气的曲块中有益菌占比较少，而断面呈黑褐色、有生心、窝水的曲块中杂菌较多，导致曲块糖化发酵功能不稳定。

图2 断面群落结构组分图（真菌）

表2 断面群落相对丰度占比（细菌) (%)

由表3可知，3个样品真菌群落结构基本类似，相对丰度占比有一定差别。其中热子囊菌属的相对丰度在各样品中占比均最大，应是根霉属类，曲霉属与热子囊菌属相对丰度占比呈此消彼长的规律。根霉属和曲霉属中的有益菌功能类似，均主要起糖化作用。从真菌属层面分析，还无法准确鉴别3个样品的功能优劣。由于目前黄曲霉和青霉的研究较多，菌种的功能和危害性已有定性，这里不做进一步分析。

表3 断面群落相对丰度占比（真菌） (%)

综合分析认为，断面呈灰白色、泡气性较好的曲块不仅糖化发酵作用强，同时也具备较优的生香等功能，即依据大曲断面菌丝颜色、泡气性以及断面生心、窝水、霉变等缺陷，能够推断出其功能性的优劣，验证了传统感官判定经验的科学性。根据内容分析，现用曲断面评价标准见表4。

表4 现用曲断面评价标准

2.3 现用曲裂缝和脱壳的分析

曲块在储存过程中水分不断散失，受物理作用容易出现裂缝和脱壳的现象，这种现象在现用曲中极为常见。为了研究裂缝和脱壳的影响性，我们采集了1.1中的4#裂缝样品，进行高通量测序研究（见图3、表5）。

由表5可知，4#裂缝样品中含有高温放线菌、魏斯氏菌、乳酸杆菌、芽孢杆菌、片球菌属、糖多孢菌属、短杆菌属等有益菌占比约63%，其中高温放线菌占比约39%，也存在杂菌过多的现象，群落结构好于3#断面样品；我们认为，裂缝的影响主要为杂菌感染，有益菌占比偏低。杂菌感染是由空气中的微生物附着生长于曲块裂缝表面造成。曲块若出现脱壳现象也会引起相应问题。因此，当现用曲出现裂缝或脱壳现象时，应将以上影响进行考量。

图3 裂缝处群落结构组分图（细菌）

表5 裂缝群落相对丰度占比（细菌）

2.4 现用曲曲壳的分析

为了更好的分析曲壳厚度对质量的影响，我们采集了大曲样品的曲壳部分进行基因测序（5#曲壳样品5 g），但由于提取的DNA浓度较低，无法进行扩增和相关测序工作。可见曲块的曲壳、火圈、断面、曲心等部分中，曲壳的微生物含量最低。曲块的主要功能是为酿酒提供酶类、菌源和香味成分，为了对曲壳进行评价，对曲块各部分进行了分析，结果见表6、表7。

表6 曲块各部分的香味品评

从曲壳的测序、香味品评和理化检测[4]结果可以看出，曲壳的香味不足，具备较强的糖化和分解蛋白质能力，但曲壳中的糖化酶和蛋白酶主要来源于粮食种子自身而不是主要由微生物产生。我们对曲壳的分析结果：具备一定的糖化、发酵、分解功能，但缺乏菌源和香味成分，酿酒作用相较于火圈和断面较弱，所以现用曲的曲壳不宜过厚。

2.5 现用曲虫害的分析

夏季天气炎热，曲虫会大量繁殖，给白酒企业带来严重的危害。据统计,夏季曲虫能吃掉大曲重量的30%～50%，造成酿酒用曲量的减少，不仅如此，还会造成曲块糖化力、液化力、微生物总数的下降。虫蛀严重的曲块还会影响到大曲的曲香，破坏大曲的表面微生物群落结构及酶系，严重影响了大曲的质量。夏季曲虫漫天飞舞，对环境卫生和工人身体健康也带来不利的影响[5]。所以对现用曲的质量评价应增加虫害控制要求。

2.6 现用曲感官标准

综合以上分析内容，我们制定了现用曲感官评分标准（60分制），评分标准见表8。

表7 曲块各部分理化检测结果

表8 现用曲感官评分标准

3 结论

3.1 存储期过后，受环境和自身影响，曲块呈现出不同的感官表象，我们可以通过对现用曲感官的观察，直观地了解曲块的质量情况，找出曲块间的质量差异。

3.2 本文对大曲的香味、断面、裂缝、脱壳、曲壳、虫害等感官进行了系统的分析，可供酿酒行业制定现用曲感官评定标准时作为借鉴。

3.3 本文制定了现用曲感官评分标准（表8），仅供行业参考。