术前中性粒细胞与淋巴细胞比值对乳腺肿瘤的预测价值及其与Beclin1的关系*

宦 宇,蔡徐山△,焦家军,张春利

(上海市嘉定区妇幼保健院:1.检验科;2.乳腺科 201821)

炎性反应与多种肿瘤相关，肿瘤的微环境在肿瘤进展中起重要作用，可促进肿瘤细胞增殖与转移。中性粒细胞与淋巴细胞计数比值(NLR)已成为全身炎性反应简单且有效的指标。有研究证明，NLR 增高在乳腺癌中可作为预后不良的独立危险因素[1]，且对乳腺癌复发和转移有预测价值[2]。Beclin1是形成自噬体的必须分子，可介导自噬相关蛋白定位于吞噬泡，并与多种蛋白反应调控自噬体形成与成熟。而自噬功能缺乏可刺激炎症小体形成,适度自噬可抑制炎性反应[3]。本研究探讨外周血NLR 与乳腺癌临床病理特征之间、自噬相关基因在乳腺癌中的表达情况，以及二者之间的关系。从而评估NLR对乳腺肿瘤的预测价值，同时试图对炎性反应、自噬、肿瘤三者之间的关系做简单解释。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2016年1月至2017年8月在本院接受手术治疗，且经病理科证实为原发性浸润性乳腺癌的患者共126例作为乳腺癌组，均为女性，年龄33～69岁，中位年龄56岁，所有病例手术前均未做过任何化疗、放疗及生物治疗。另选取同期病理检查均为纤维腺瘤的良性乳腺肿瘤患者102例作为乳腺良性肿瘤组，乳腺良性肿瘤组病例也均为女性，年龄31～67 岁，中位年龄52岁。乳腺癌肿瘤组织为术中取得，同时选取距离病灶位置至少3 cm处的癌旁组织进行比较，所有组织标本均置于RNALater保存液中-80 ℃冰箱保存。所有患者的临床资料，如肿瘤块大小、肿瘤级别、淋巴结入侵情况、雌激素受体(ER)、孕激素受体(PR)、人表皮生长因子受体2(HER2)的表达等均来自本院病理科。排除标准：70岁以上患者;术前感冒或其他可影响血常规计数结果的疾病患者。

1.2仪器与试剂 全自动血细胞分析仪MEK-8222k极其配套试剂(日本光电公司)，荧光定量聚合酶链反应(PCR)仪(ABI 7300)，反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)试剂盒(TAKARA公司)，RNAlater(QIAGEN公司 )，Tizol试剂。

1.3方法

1.3.1血标本采集与处理 患者于术前2 d内采集晨起空腹外周静脉血2 mL，乙二胺四乙酸二钾(EDTA-K2)抗凝。采血当天无发热等临床感染征象。检测白细胞、中性粒细胞及淋巴细胞计数，外周血NLR 由中性粒细胞计数/淋巴细胞计数获得，检测在2 h内完成。

1.3.2RT-PCR分析 按Tizol试剂说明书步骤提取组织总RNA。Beclin1、GAPDH引物均由上海英淮捷基公司合成。Beclin1上游引物序列为5′-GGC TGA GAG ACT GGA TCA GG-3′，下游引物序列为5′-CTG CGT CTG GGC ATA ACG-3′,产物长度为364 bp。GAPDH上游引物序列为5′-ACT TTG GTA TCG TGG AAG GAC TCA T-3′,下游引物序列为5′-GTT TTT CTA GAC GGC AGG TCA GG-3′,产物长度为255 bp。反转录扩增条件：37 ℃ 15 min；85 ℃ 5 s；4 ℃ 1 min。PCR扩增条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 45 s，70 ℃ 50 s，循环40次；70 ℃ 5 min。

2 结 果

2.1外周血NLR与乳腺良、恶性肿瘤的关系 乳腺良性肿瘤组NLR为1.22±0.29，乳腺癌组为2.10±0.78，两组差异有统计学意义(t=11.72，P<0.05)。

2.2乳腺癌组术前外周血NLR与临床病理特征的关系 见表1。不同年龄分组中NLR差异有统计学意义(P<0.05)；无淋巴结转移患者NLR明显低于有淋巴结转移患者，差异有统计学意义(P<0.05)；Ki67表达率大于或等于20%的患者NLR明显高于表达率低于20%的患者，差异有统计学意义(P<0.05)；而肿瘤直径、病理分级、ER、PR、HER-2等临床病理特征分组中NLR差异无统计学意义(P>0.05)。

表1 乳腺癌组术前外周血NLR与临床病理特征的关系

2.3乳腺癌组织和癌旁组织中Beclin1 mRNA的表达 随机挑选20例乳腺癌组织和与其对应的癌旁组织，采用RT-PCR检测组织中Beclin1 mRNA表达水平。图1所示，乳腺癌组织中Beclin1 mRNA表达水平平均为1.35±0.96，而癌旁组织平均为 3.17±1.59,两组差异有统计学意义(P<0.05)。在80%(16/20)的标本中发现，Beclin1在乳腺癌组织标本中表达下调，另有20%(4/20)的标本中未发现Beclin1在乳腺癌组织中表达下调。

图1 乳腺癌和癌旁组织标本中Beclin1mRNA表达水平

2.4Beclin1 mRNA的表达和外周血NLR的关系 根据肿瘤组织和癌旁组织Beclin1 mRNA表达水平差异情况,将上述20例患者标本分为Beclin1 mRNA表达下调组和未下调组，结果显示，Beclin1 mRNA下调组外周血NLR为3.15±1.54,未下调组为1.07±0.19,两组差异有统计学意义(t=-3.714,P<0.05)。

3 讨 论

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，近年其发病率已位居我国女性恶性肿瘤的首位，且逐年递增[4-6]。近年研究发现，NLR与多种实体肿瘤的预后相关，可能原因是升高的NLR与炎性反应相关[7-10]。NLR 在临床中有获取简便，不额外增加检测费用，临床可操作性强等优点。细胞自噬是不同于凋亡且不依赖于caspase的一种程序性细胞死亡，它作为程序性细胞死亡的另一种形式，近年来受到广泛关注。第一个哺乳动物自噬基因是Beclin1，它是哺乳动物参与自噬的特异性基因，广泛存在于人类正常组织中。

本研究发现,术前外周血乳腺癌组较乳腺良性肿瘤组NLR明显升高，提示NLR有助于判断乳腺良、恶性病变。NLR所受干扰因素较多，如感冒、高血压、肾脏疾病、糖尿病、高胆固醇等，甚至吸烟、饮食、饮酒等生活习惯也会干扰其检测结果，所以目前NLR用于乳腺肿瘤良、恶性判断的临界值尚很难确定，临床工作中仍然最终需要病理活检作为诊断的金标准。但本研究结果提示,NLR可作为判断乳腺肿瘤良、恶性病变的一项参考指标。

詹妍等[1]研究发现,NLR与淋巴结转移数目、TNM分期及ER、PR、HER2相关,与年龄等因素无关；胡赟宏等[2]研究发现,NLR仅与淋巴结转移数目相关，与其他临床病理因素均无关。本研究结果显示,NLR在年龄大小、有无淋巴结转移、Ki67表达率高低患者间有明显差异。但未发现与其他乳腺癌相关临床特征相关，这可能是因为NLR受病理生理因素影响较大，不同的研究者统计分析结果存在差异，所以还需更大标本量的研究予以证实。另有研究发现，NLR可能与乳腺癌不同的分子分型相关[11]，这一结果为进一步研究提供了思路和方向。

有学者采用免疫组织化学法分析乳腺癌细胞系和乳腺癌及其与之对应的正常乳腺组织。Beclin1免疫活性在正常乳腺上皮细胞中强烈表达,而乳腺癌组织中的表达水平却明显下降。本研究采用RT-PCR检测Beclin1 mRNA的表达水平，结果显示，Beclin1 mRNA在乳腺癌组织的表达低于癌旁组织，与文献[12-13]报道一致。

有研究发现,炎性反应介质中的活性氧细胞因子及炎性反应相关转录因子可调控自噬反应，而自噬反应又可通过TLR、NLR 等信号通路来调节炎性反应，并且自噬反应是诱发炎性反应性疾病的重要因素[14]。对于信号、转导通路及调节自噬体形成和成熟过程的相关信号通路的分子机制和功能研究表明,Ⅰ型磷酸肌醇3-激酶-蛋白激酶B信号转导通路和腺苷酸活化蛋白激酶信号通路都可调节自噬反应的过程，换句话说自噬反应与癌症的发生和发展有关[15]。本研究为了初步探讨炎性反应、自噬、肿瘤三者之间的关系，根据Beclin1 mRNA的表达下调情况将肿瘤患者进行分组分析发现，Beclin1 mRNA表达下调组外周血NLR与未下调组差异有统计学意义(P<0.05)。但由于本研究标本量有限，且缺少相关机制研究，炎性反应、自噬反应、肿瘤三者之间的关系是否确实如本研究结果所示，还有待进一步验证。