炎症因子风暴对老年小鼠感染免疫应答的影响

袁松华，何涌泉，徐建青,2， 张晓燕,2*

(1.复旦大学附属公共卫生临床中心，上海 201508；2.复旦大学生物医学研究院，上海 200032)

高致病性流感病毒H5N1[1]、H7N9[2]感染研究均提示重症流感样感染的重要特征是宿主体内免疫应答失调，出现肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)和白介素6(interleukin 6，IL-6)等炎症因子以及白介素8(interleukin 8，IL-8)，C-C型趋化因子配体(C-C chemokine ligand 2，CCL2)等趋化因子过度表达，免疫学上定义为炎症因子风暴[3]。出现炎症风暴的宿主临床症状表现为持续发热，下调淋巴细胞，出现重症肺炎、肺重症损伤等严重的呼吸道症状，是临床转归不佳的重要因素[4]。从免疫机制来说，炎症风暴是调节免疫应答的关键因素[5]，主要诱发组织局部炎症，直接损伤肺毛细血管粘膜，促使肺泡水肿和表面活性蛋白失活。失控的炎症风暴会进一步弥散炎症和肺泡结构的破损造成机体肺血氧不足，最终发展为急性呼吸窘迫症(acute respiratory distress syndrome, ARDS)[6-7]。

现有研究发现炎症风暴尽管不是呼吸道病毒感染特异性的，但与宿主感染病毒后高致死率显著正相关[8]。团队前期研究发现老年感染者炎症应答过度，以IL-6，IL-8为主要的炎症、趋化因子高表达，肺内灌洗液(bronchoalveolar lavage，BAL)内的炎症因子浓度近乎外周1000倍以上[9]。另外通过老年感染者肺组织病理染色发现，肺泡细胞壁增厚，肺泡间隙进一步被压缩，更多的炎性淋巴细胞趋化至病灶，造成多处不可逆损伤。成年小鼠的流感病毒(H1N1)感染模型已经证实[10]，流感病毒感染可有效诱发I型干扰素的迅速上调，炎症因子前体的分泌进一步刺激了其他炎性因子表达上调，继而激活树突状细胞、巨噬细胞、上皮细胞等。多种固有免疫细胞迅速被动员，参与抗病毒的炎症应答，级联放大炎症应答。在流感病毒感染过程中，炎症风暴如何影响老年感染者肺内免疫细胞应答的机制尚且没有得到解析。因此，本课题组拟利用老年小鼠感染H9N2病毒的免疫模型，重现肺内炎症风暴，从组织学和细胞学角度解析，对肺巨噬细胞、肺中性粒细胞等主要免疫细胞应答的影响，为回答流感病毒感染引发的炎症风暴如何影响老年宿主临床转归的科学问题提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 流感病毒

H9N2病毒经MDCK细胞和鸡胚培养滴定后，-80℃储存备用。实验均在动物生物安全三级实验室(ABSL-3)中进行。[高致病性病原微生物实验室资格证书编号为卫BSL3-007；中国合格评定国家认可委员会实验室认可证书编号NO.CNAS BL0016]，研究方法经过上海市公共卫生临床中心动物伦理委员会审查(编号为：2014伦审K007号)。

1.2 实验动物

实验小鼠均选用SPF级别雌性C57小鼠，6～8周龄(18～19 g)和8月龄小鼠(22～24 g)(每种小鼠各30只)均购于上海西普尔-必凯实验动物有限公司[SCXK(沪)2013-0016]，8月龄小鼠在上海市公共卫生临床中心实验动物部SPF区域[SYXK(沪)2015-0008]继续饲养至18～24月龄(28～30 g)。

1.3 实验方法

1.3.1 老年小鼠流感病毒感染方案

研究对象：受试小鼠提前24 h转入生物安全实验室适应，分为老年感染组、成年感染组、老年未感染对照组以及成年未感染对照组共计4大组，每组小鼠10只。小鼠腹腔注射100 μL 1%戊巴比妥钠溶液全身麻醉，5×106EID50H9N2流感病毒经鼻腔攻击，记录各组小鼠感染后连续14 d的体重变化、生存情况。

1.3.2 石蜡切片免疫组化染色

将肺组织在10%的福尔马林溶液，静置固定24 h，包埋于石蜡中。蜡块制备为10 μm切片(白片)数张备用。60℃烤片1 h，依此在二甲苯，无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇依次浸泡脱蜡3～5 min，在柠檬酸盐缓冲液沸水浴中抗原修复5 min， PBS溶液洗涤3次，血清室温封闭20 min，加入相应的一抗anti-Macrophage(1∶100使用，克隆号：11H3，货号：GTX53120)或Anti-Neutrophil Antibody(1∶100使用，克隆号：NIMP-R14，货号：LS-C139871)，4℃孵育过夜后，PBS溶液洗去一抗后，室温加入二抗孵育(HRP抗体)30 min，PBS溶液再次洗去二抗后，DAB溶液染色3～10 min，显微镜下观察终止染色。自来水冲洗切片后，苏木素溶液复染30 s，自来水再次洗去染液，晾干切片，封片。全部切片由奥地利TissueGnostics类流式组织定量细胞分析仪拍摄分析。

1.3.3 炎症-趋化因子检测

收集感染急性期内(第1、2、3、7天)小鼠肺内灌洗液和外周血，肺灌洗液4℃，12 000 r/min离心5 min，分装上清，将外周血混入抗凝剂(3.8%枸椽酸钠溶液与全血1∶9混合)重复混匀，3000 r/min离心10 min，分装上清。分别取50 μL肺灌洗液、血浆和梯度稀释后标准品，依次加入50 μL预混多因子磁珠，50 μL PE标记的荧光染色溶液，室温避光孵育2 h。200 r/min离心5 min，用试剂盒内专用的洗涤缓冲液洗1次，每管终体积为100 μL。全部标本由美国BD公司的LSR Fortessa多色流式细胞仪分析获取数据。

1.3.4 肺内T淋巴细胞染色

收集感染后第7天的小鼠肺组织，含10%FBS的1640培养液洗涤2次，每只小鼠取2 g组织，无菌眼科剪处理成小于1 mm3组织小块。消化液(含1%I型胶原酶和0.5%的DNase)37℃孵箱内处理3～5 h，组织完全消散。将细胞悬液经100 μmol/L无菌滤网获得最终单细胞悬液。每个标本选取106单细胞悬液，anti-CD4(2D4)、anti-CD8(11C) 室温避光染色10 min，含10%FBS的PBS染色缓冲液洗涤1次，500 r/min离心5 min，弃去上清，每管终体积为100 μL。全部标本由美国BD公司的LSR Fortessa多色流式细胞仪分析获取数据。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 感染H9N2病毒后，老年小鼠出现炎症风暴，且集中在肺内局部

收集小鼠感染H9N2病毒后第1，2，3，7天共计四个时间点的外周血。图1a定量检测了血浆中炎症因子(IL-6，TNF-α)趋化因子MCP-1和干扰素IFN-γ在血清中表达，除MCP-1表达量为100 pg/mL,其余因子均低于50 pg/mL。流感病毒H9N2是经鼻腔由呼吸道入侵宿主，因此进一步收集了收集小鼠感染H9N2病毒后第1，2，3，7天共计四个时间点的肺泡灌洗液。动态分析结果显示老年感染鼠肺内的炎症因子IL-6和趋化因子MCP-1异常高表达，在感染后第2天达到峰值，超过4000 pg/mL，是成年对照峰值表达量的100～1000倍(图1b)。另外，在肺内，不管是老年小鼠还是成年对照，均表达相近水平的炎症因子TNF-α(峰值约1000 pg/mL)，且动态变化趋势也一致，是两组不同月龄小鼠感染H9N2病毒后共性的炎症应答。本课题组还发现干扰素IFN-γ 在老年小鼠感染后第7天内表达上调，而成年对照则无应答。

注：收集小鼠感染H9N2病毒后第1，2，3，7天共计四个时间点的外周血。检测血浆中炎症因子(IL-6，TNF-α)趋化因子MCP-1和干扰素IFN-γ。图1a 老年小鼠感染H9N2病毒后，外周血中炎症-趋化因子的表达情况Note.Peripheral blood of mice infected with H9N2 virus was collected for the first 1, 2, 3, and 7 days. Chemokines (IL-6 and TNF-α), MCP-1, and IFN-γ were detected in plasma.Figure 1a Expression of inflammatory cytokines in the periphery blood of aged mice infected with H9N2 virus

注：收集小鼠感染H9N2病毒后第1，2，3，7天共计四个时间点的肺灌洗液。检测灌洗液(BAL)中炎症因子(IL-6，TNF-α)趋化因子MCP-1和干扰素IFN-γ。图1b 老年小鼠感染H9N2病毒后，肺内炎症-趋化因子的表达情况Note.Lung lavage fluid of mice infected with the H9N2 virus was collected on the first 1, 2, 3, and 7 days. Chemokines (IL-6 and TNF-α), MCP-1, and IFN-γ were detected in BAL.Figure 1b Expression of inflammatory cytokines in the lung of aged mice infected with H9N2 virus

2.2 感染H9N2病毒后，老年小鼠肺巨噬细胞应答不足，中性粒细胞应答滞后

图2a 老年小鼠感染H9N2病毒后，肺内巨噬细胞的动态变化(×200)Figure 2a Dynamic changes in alveolar macrophages of the aged mice infected with H9N2 virus

注：组织类流式定量细胞分析仪(奥地利，Tissue Gnostics公司)进行图像定量分析，每只小鼠肺组织切片标本随机选取3张，每张切片随机选取10个高倍镜视野，测定每个视野下免疫阳性细胞密度(单位为每平方毫米的细胞计数)。与成年对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图2b 老年小鼠感染H9N2病毒后，肺内巨噬细胞的定量分析Note. Quantitative analysis was performed with a tissue flow quantitative cell analyzer (Austrian Tissue Gnostics). Three specimens of mouse lung tissue biopsies were randomly selected for observation at ×10 magnification. Positive cell density (cell count per mm2) was determined in each field.Compared with adult mice, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Figure 2b Quantitative analysis of alveolar macrophages in aged mice infected with H9N2 virus

利用免疫组化技术分析了急性感染期内(第1、2、3和7天)肺巨噬细胞的动态变化，带有蓝色细胞核灰褐色小圆型细胞样结构被判定为阳性细胞。切片应用组织类流式定量细胞分析仪(奥地利，Tissue Gnostics公司)进行定量分析，测定每个视野下(图2a，图3a)免疫阳性细胞密度(单位为每平方毫米的细胞计数)。统计结果显示发现H9N2感染后，老年小鼠的肺内巨噬细胞(图2b)在感染后第1天迅速趋化，增殖，但是显著弱于成年小鼠。感染后时间动态变化提示，肺内巨噬细胞在感染后第1天达到峰值，第2、3和7天逐渐减少。同时观察免疫组化染色肺内原位中性粒细胞的应答情况。小鼠感染H9N2病毒后，肺内中性粒细胞(图3b)在第1、2天增加，第2天达到峰值，然后在感染后第3至第7天逐渐减少。与巨噬细胞不同的是，老年小鼠在感染第1、2天显著低于成年对照，而在感染后第3至第7天却显著高于成年对照。这样的实验现象提示，与成年对照相比，感染H9N2病毒的老年小鼠肺巨噬细胞应答不足，而肺中性粒细胞感染急性早期应答同样不足，但在急性后期却在肺内大量滞留。

图3a 老年小鼠感染H9N2病毒后，肺内中心粒细胞的动态变化(×200)Figure 3a Dynamic changes of pulmonary neutrophils in the aged mice infected with H9N2 virus

注：组织类流式定量细胞分析仪(奥地利，Tissue Gnostics公司)进行图像定量分析，每只小鼠肺组织切片标本随机选取3张，每张切片随机选取10个高倍镜视野，测定每个视野下免疫阳性细胞密度(单位为每平方毫米的细胞计数)。与成年对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。图3b 老年小鼠感染H9N2病毒后，肺内中性粒细胞的定量分析(×200)Note. Quantitative analysis was performed with a tissue flow quantitative cell analyzer. Three specimens of mouse lung tissue biopsies were randomly selected for observation at ×10 magnification. Positive cell density (cell count per mm2) was determined in each field. Compared with the adult mice, *P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。Figure 3b Quantitative analysis of pulmonary neutrophils in the aged mice infected with H9N2 virus

注：收集小鼠感染H9N2病毒后第7天的肺组织，消化成单细胞，计数肺内总细胞数量。阴性分选肺内CD4+T淋巴细胞和CD8+T淋巴细胞。分别计数后，计算CD4+T和CD8+T淋巴细胞占肺内总细胞的比例。与成年对照组比较，*P<0.05。图4 老年小鼠感染H9N2病毒后第7天，肺内T淋巴细胞的数量和比例Note. Lung tissue of mice infected with H9N2 virus was collected at day 7, digested into single cells, and the total number of cells was counted. CD4+ and CD8+ T lymphocytes were negatively sorted. After counting, the ratio of CD4+ T and CD8+ T lymphocytes to the total cells in the lung was calculated. Compared with adult mice, *P<0.05。Figure 4 Number and proportion of pulmonary T cells in the aged mice at day 7 post-infection

2.3 感染H9N2病毒后第7天，老年小鼠肺内CD8+T淋巴细胞数量显著减少。

在感染后第7天收集小鼠肺脏，肺脏在I型胶原酶消化液中解离成单个细胞悬液，对于肺内总细胞进行计数。分别使用StemCellTMCD4或CD8阴性磁珠分选试剂盒分选出对应的T淋巴细胞，分别进行计数。取其中部分细胞分别在表面染色标记CD4-FITC、CD8-PE，结果显示阳性率大于95%(数据未展示)。统计结果(图4)显示未感染条件下，与成年对照相比，老年小鼠肺内CD4+、CD8+T淋巴细胞的数量和比例无显著性差异。感染H9N2病毒后第7天，CD4+T淋巴细胞的数量和比例以及CD8+T淋巴细胞的比例则依然维持不变，而老年小鼠肺内CD8+T淋巴细胞的数量则显著降低。

3 讨论

本团队前期临床研究发现H7N9的老年感染者主要过量上调炎症因子IL-6、趋化因子IL-8，另一种重要的炎症因子TNF-α等却没有发现其表达上调。重症感染后，免疫稳态的失衡，宿主体内产生炎症风暴[9]。但IL-6、IL-8的分泌占据大部分的比例，是否抑制了其他炎症通路的活化或是其他通路活化的负反馈，促进IL-6、IL-8因子的高表达。IL-10是一种通常意义的负向调控因子，主要功能是调节免疫平衡，防止免疫应答过度活化[11]。临床研究中三名危重病人肺内灌洗液中检出很少的IL-10因子表达，肺内炎症因子选择性暴增的机制目前没有得到解析。老年小鼠感染H9N2病毒后，炎症因子IL-6、趋化因子MCP-1同样在小鼠肺内过量表达，老年小鼠肺内炎症风暴主要以炎症因子IL-6和趋化因子MCP-1为主，峰值表达超过4000 pg/mL，而成年小鼠肺内炎症因子TNF-α、IL-6表达上调，峰值表达500～1000 pg/mL。有意思的是，本课题组在感染后症状轻微的成年小鼠肺内灌洗液中检测出负调控因子IL-10上调(数据未显示)。老年小鼠感染H9N2后，与成年被感染小鼠相比，体重下降显著，死亡率仅为50%。因此，高水平的炎症因子风暴对应了重症的临床转归情况，与本团队2013年度H7N9感染者临床现象相符。

肺巨噬细胞是一群定居在肺组织内固有免疫细胞，对于维持肺组织免疫稳态具有关键作用[12]。与其他类型巨噬细胞明显不同，肺巨噬细胞在原位自我更新[13]，而不是从迁徙来的单核细胞分化更新[14]。肺巨噬细胞主要参与静息状态下肺组织的损伤修复、宿主抵御系统性抗病毒或细菌的感染。小鼠感染H9N2流感病毒后，肺巨噬细胞结合出现凋亡的靶细胞且降解处理，其分子机制已经在体外细胞模型中报道，肺巨噬细胞表面高水平表达的CD204分子，是重要的肺内清除功能受体[15]。另外有报道发现衰老的肺巨噬细胞表面的CD204分子表达下降，与清除凋亡细胞功能的下降呈正相关[16]。本课题组的研究发现老年小鼠感染H9N2病毒后，肺巨噬细胞上调显著低于成年对照。呼吸道病毒感染过程中，肺巨噬细胞主要是通过分泌I型干扰素招募炎症单核细胞[17]。肺巨噬细胞不是唯一的肺内具有免疫吞噬功能的固有免疫细胞，树突状细胞以及被招募的单核淋巴细胞同样承担一系列的免疫吞噬能力。相对于年轻对照，感染H9N2病毒的老年小鼠肺内中性粒细胞的滞留更加严重。大量的中性粒细胞的富集在肺组织局部，进一步恶化了肺内炎性环境，造成更严重的肺损伤。肺内的高炎性环境招募中性粒细胞的侵润，大量的中性粒细胞在肺内长时间滞留，又进一步上调炎症因子，最终造成肺损伤。因此，老年小鼠感染H9N2病毒后，肺内参与抗感染的固有免疫应答细胞种类没有发生改变，但值得注意的是，巨噬细胞在肺内的数量出现显著下降，中性粒细胞的迁徙能力同样发生显著减弱。

在流感病毒感染免疫过程中，相对于固有免疫应答，获得性免疫应答是抗原特异的，由专职的抗原递呈细胞进行抗原处理加工，因此免疫应答的发生时相要晚于非特异应答。在感染免疫应答期，感染H9N2的老年小鼠肺内辅助性T细胞的比例和数量，与成年小鼠相当。但有报道指出在致死性流感模型中，老年小鼠肺间质中定居的CD69+CD8+T细胞数量显著下降[18]，这群特殊的细胞发现具有长时间生存能力，同时是抗流感病毒感染的重要T细胞亚群。本课题组研究同样确认了重症感染流感病毒的老年小鼠肺内CD8+T细胞的显著减少，证实感染后特异性细胞杀伤应答的强度显著降低，但具体属于哪类亚群还需要进一步确认。

与其他年龄对照组相比，老年人群在重症流感感染过程中有合并下呼吸道感染的风险。临床上肺部听诊、C反应蛋白以及胸部射线检查均提示老年流感重症感染者具有较高的肺部感染发生率。本课题组前期建立的老年小鼠感染流感免疫模型已经确认老年宿主感染流感病毒后预后不佳。感染流感病毒后，老年小鼠肺内炎症因子的异常高水平上调，导致肺巨噬细胞的应答下降，中性粒细胞迁徙能力减弱，过量表达的炎症进一步下调了老年小鼠肺内CD8+T细胞，削弱了抗感染的细胞毒杀伤应答。因此，高水平的炎症风暴直接或间接导致老年小鼠出现重症的临床转归，但肺内炎症风暴如何调控肺内固有免疫细胞应答的分子学相关机制还有待于后续的研究。