以还原型谷胱甘肽干预慢性酒精中毒动物模型升主动脉力学特性分析

逯 遥，姜东莉，刘 洋，齐 兵*

(吉林大学中日联谊医院 1.中医科；2．药学部， 吉林 长春130033)

高脂饮食和过量饮酒是一种十分普遍的不良生活方式,嗜酒、酗酒、酒精依赖导致酒精中毒呈年轻化趋势,严重危及人类健康和社会安定。滥用酒精已经成为世界性的问题。长期大量饮酒可引起高血压、脑卒中、酒精性心肌病和心律失常[1]。

以往的研究[2，3]均未涉及慢性酒精中毒模型以阿拓莫兰治疗后的升主动脉的生物物力学特性对比分析，因此，对慢性酒精中毒模型以阿拓莫兰干预治疗后，升主动脉的生物力学特性对比分析显得十分迫切和必要。我们推测慢性酒精中毒病动物模型升主动脉拉伸力学特性发生改变，以阿拓莫兰治疗后可能会在一定程度恢复其力学性能。本实验复制Sprague-Dawley大鼠慢性酒精中毒模型，以阿拓莫兰对大鼠慢性酒精中毒模型进行干预治疗后对各组大鼠血清的生物学指标MDA、SOD、MT进行测定，对大鼠升主动脉进行拉伸力学性能实验，以大鼠血浆生物学指标MDA、SOD、MT和大鼠升主动脉生物力学指标研判阿拓莫兰对大鼠酒精中毒的疗效。

1 材料与方法

1.1 实验动物

雄性5月龄SD大鼠60只，体重245-248 g由长春高新医学动物实验研究中心提供[许可证号：SCXK-(吉)：2003-0004]。

1.2 药物

还原型谷胱甘肽,重庆药友制药有限公司。

1.3 实验大鼠分组

大鼠饲养1周后,60只大鼠随机分为对照组20只、慢性酒精中毒模型组(以下简称模型组)20只，慢性酒精中毒模型以还原型谷胱甘肽干预组(以下简称干预组)20只。

1.4 大鼠酒中毒模型复制与药物干预

按参考文献[4]的方法建立慢性酒中毒大鼠模型:第1 周以酒精浓度为5%、第二周以酒精浓度10%、第三周以酒精浓度20%、 第4-8周以35%(V/V)浓度(乙醇3.50 g· kg-1· d-1)对大鼠灌胃;以同等体积的生理盐水10 ml· kg-1· d-1对正常对照组大鼠灌胃 。建模60 d 后，大鼠性情不稳定，毛发无光泽，精神萎靡、烦躁不安，反应淡漠、行动迟缓、 食欲减退， 重者体态呆板、流涎、 嗜睡， 活动明显减少， 进食量减少， 体 重 增 长 缓 慢 ， 证 明 慢 性 酒 精 中 毒 模 型 复制成 功。对模型组大鼠于造模第60 d 后开始每只大鼠每天注射还原型谷胱甘肽(阿拓莫兰)400 mg /k g，连续注射3周。

1.5 仪器和试剂

MDA、SOD、MT试剂盒( 南京建成生物工程研究所);KDC 40 离心机( 科大创新股份有限公司中佳分公司)。

1.6 大鼠升主动脉试样切取与试样加工

各组大鼠建模60天后，以腹腔注射(水合氯醛(0．3 ml/100 g)的方法麻醉大鼠后开胸，在镇江市卓创医疗科技有限公司生产的ZC-x-6A手术显微镜下找到大鼠升主动脉，以浙江省遂昌双剑医疗器械有限公司生产的无菌塑柄手术刀切取各组大鼠升主动脉，每组各20个长为20 mm的升主动脉标本，将升主动脉标本置于生理盐水槽中。

1.7 大鼠血清制作

对各组大鼠行剪尾取血，每只大鼠 采血 8 ml，在常温下静置 45 min，低速离心机以 2 000 r/min 离心 20 min，取上清，置于 1.5 ml 离心管内，置于-20℃冰箱保存，待测量金属硫蛋(metallothionein，MT、超氧化物歧化酶(Super Oxide Dismutase，SOD)丙二醛(malondialdehyde，MDA) 含量。

1.8 各组大鼠血清中MDA、MT、SOD 的测试方法

按丙二醛(MDA)试剂盒操作说明，采用硫代巴比妥酸比色法测定大鼠脑组织匀浆MDA含量；大鼠脑组织匀浆中MDA含量 (nmol/ml)=(测定管吸光度-测定空白管吸光度)(标准管吸光度-标准空白管吸光度)标准品浓度(10 nmol/ml)x样品测试前稀释倍数。

按MT试剂盒操作说明，采用硫代巴比妥酸比色法测定血浆MT含量。

按SOD试剂盒操作说明，以日本东京日立公司U3410 分光光度仪采用黄嘿吟氧化酶(XO)法测定大鼠血浆SOD含量。

1.9 大鼠升主动脉拉伸实验方法

实验设备采用长春试验机研究所生产的电子万能试验机(长春，吉林省，中国)，试验机配有温控仪、环境温箱，根据需要可自行设定实验环境温度。以长春市第三仪器厂生产的CCs-3型读数显微镜测量各组大鼠升主动脉试样的直径，以还原型谷胱甘肽干预组大鼠升主动脉试样直径1.01-1.04 mm、慢性酒精中毒大鼠模型组大鼠升主动脉试样直径0.99-1.03 mm、对照组大鼠升主动脉试样直径1.02-1.05 mm，实验环境温度设定为36.5℃±0.5℃，按参考文献[16-18]的方法对各组大鼠升主动脉试样进行预调，分别将每个预调过的试样装夹于试验机的夹具内，以2 mm/min的载荷增加速度对试样进行实验。为了保持试样湿度，实验中向试样喷洒生理盐水。实验结束后,计算机自动输出 试样的弹性模量、最大应变、最大应力、弹性限度应变、弹性限度应力，应力-应变曲线等。

1.10 统计学处理

2 结果

2.1 大鼠血清MT、 MDA、SOD 测试结果

各组大鼠血清中MT、 MDA、SOD 测试结果见表1。谷胱甘肽干预组SOD含量和MT含量大于模型组，MDA含量小于模型组，差异显著(P<0.05)。

2.2 大鼠升主动脉试样拉伸实验结果

大鼠升主动脉试样拉伸实验结果见表2。

表1 各组大鼠血清中 MT、 MDA、SOD测试结果(n=20)

注：与模型组比较*P<0.05

表2 大鼠升主动脉拉伸实验结果

注：与模型组比较，*P<0.05

2.3 各组大鼠升主动脉试样应力-应变曲线

各组大鼠升主动脉试样的应力-应变曲线见图1。

图1 各组大鼠升主动脉试样应力-应变曲线

2.4 大鼠升主动脉试样应力-应变关系表达式的构建

以回归分析的方法，由各组大鼠升主动脉试样拉伸实验得出的应力、应变数据建立各组大鼠升主动脉试样的应力-应变函数关系表达式，结果如下：

对照组：σ(ε)=0.0000e5-0.0001e4+0.031e3+ 0.58526e2+2.252e

模型大鼠组：σ(ε)=0.0000e5+0.0003e4+0.0237e3+0.0680e2+2.8429

以谷胱甘肽干预组：σ(ε)=0.0000e5-0.0001e4+0.0134e3+0.0797e2+3.0715e

3 讨论

各组大鼠血浆中MDA、SOD、MT的测定结果表明，以谷胱甘肽干预组SOD含量和MT含量大于模型组，MDA含量小于模型组(P<0.05)。分析认为大鼠酒中毒后使心、脑血管组织缺缺氧、缺血，从而引起心、脑组织自由基释放，造成SOD值下降，MDA值上升，大鼠酒中毒模型通过以谷胱甘肽干预后提高了SOD值，降低了MDA值。谷胱甘肽具有一定的提高自由基的代谢能力的作用。有研究表明，金属硫蛋白MT是一种高效的自由基清除剂，对在氧化应激状态下机体组织、细胞具重要的保护作用；MT可直接捕获多种活性氮和自由基，起到清除自由基的作用[4]。酒精在体内代谢后会产生大量自由基，并通过氧化应激反应引起神经细胞损伤，金属硫蛋白MT作为一种具有高效保护性蛋白，发挥重要的抗氧化作用。分析认为，长期的酒精摄入会使动物心、脑组织内MT含量发生变化.模型组MT含量的降低，说明心、脑组织清除自由基的能力下降。酒精中毒使大鼠心、脑组织受到损伤后造成氧化应激反应，这种氧化应激反应可能是慢性酒精中毒性心、脑损害的发病机制之一；长期大量酒精摄入可导致动物心、脑组织中氧自由基的产生与清除失衡，从而导致心、脑组织损伤，氧化应激可能是慢性酒精脑损害的中间环节或始动因素，对慢性酒精中毒患者要尽早进行抗氧化治疗，中断氧化应激反应的恶性循环，使氧自由基的平衡状态得到恢复[5]。

各组大鼠升主动脉试样拉伸实验结果表明,对照组大鼠升主动脉试样拉伸弹性限度应力、弹性限度应变、最大应力、最大应变大于模型组和谷胱甘肽干预组，其弹性模量小于模型组和谷胱甘肽干预组，差异显著(P<0.05)，有统计学意义。以谷胱甘肽干预组升主动脉拉伸弹性限度应变、弹性限度应力、最大应变、最大应力大于模型组，其弹性模量小于模型组，差异显著(P<0.05)。有研究表明[6]，酒精中毒大鼠心血管都有炎症损伤，酒精对心血管炎症的反应最为强烈。提示:酒精中毒后可以引起炎症损伤，使心血管自身结构的改变，对血流产生影响,造成心肌缺血缺氧性改变。血管壁中平滑肌细胞，弹性纤维、胶原纤维的结构成份的含量和空间构型对血管的生物力学性质起着决定性的作用[7]。胶原纤维中的胶原组织在载荷作用下具有抵抗应变和应力的作用、弹性纤维中的胶原组织在应力作用下具有延伸的作用[8]。分析认为，由于酒精中毒模型组大鼠血管炎症损伤，自身结构发生了改变，升主动脉的拉伸力学性力学性质也发生改变。

还原型谷胱甘肽广泛分布于人体各器官内,对保护细胞膜的完整性、维持细胞生物功能具有重要作用,能参与过氧化物及自由基本结合、体内氧化还原过程,以保护细胞膜中含巯基的蛋白质和含巯基酶不被破坏,对抗氧化剂对巯基的破坏，对抗自由基对人体重要器关的损害[9-11]。当细胞内生成少量过氧化氢时,GSH在谷胱甘肽过氧化物酶的作用下,把H2O2还原成水,其自身被氧化GSSG。GSSG在谷胱甘肽还原酶的作用下,从NADPH+接受氢又被还原为GSH；GSH还可以和有机过氧化物起作用。这些过氧化物是需氧代谢的有害副作用,谷胱甘肽在这种解毒中起着关键性作用[12]。谷胱甘肽作为外源性自由基清除剂,既可以抑制过多的自由基,还可以挽救缺血组织,减少神经细胞的损伤阻止自由基产生的正反馈效应，谷胱甘肽具有解毒作用[13]。本实验结果表明，谷胱甘肽干预治疗酒精中毒慢性疗效显著。

本文的特点是研究了以谷胱甘肽干预治疗慢性酒精中毒模型和正常大鼠升主动脉的拉伸力学性能，以回归分析的方法建立了慢性酒精中毒模型组、对照组、以谷胱甘肽干预治疗组升主动脉的应力-应变函数关系表达式，以数学统计学模型验证各组大鼠升主动脉拉伸应力-应变实验数据，大鼠升主动脉的应力-应变函数关系表达式的构建能更好的阐明慢性酒精中毒模型组和对照组、以谷胱甘肽干预治疗组大鼠升主动脉脉的拉伸力学性质，为慢性酒精中毒造成升主动脉损伤的发病机制提供生物力学方面的理论依据。