高发区早期贲门癌及癌前病变蛋白质组学中的应用研究

陈仙梅 郭硕 袁丽

摘 要：目的 應用MALDI-TOF-MS技术检测高发区贲门癌前病变及早癌血清中相关差异蛋白，并利用ExPasy数据库检索相关差异蛋白峰，探讨差异蛋白峰与在肿瘤发生相关性。方法 收集来自高发区经病理证实的血清标本259例，其中53例LGIN组，89例HGIN组，60例IGCA组和57例NOR组，采用弱阳离子交换纳米磁珠对血清蛋白进行纯化，MALDI-TOF-MS质谱进行检测。结果 三组病变组与NOR组比较以及各组间比较，有统计学差异蛋白峰193个，其中由15个差异蛋白峰1025、1190、1212、1315、1547、1561、1612、3452、3518、4485、5527、7992、8712、14063、33313建立的诊断模型为最优诊断模型。该模型对贲门癌前病变及癌的特异性为100.00%，LGIN的灵敏度100.00%，HGIN的灵敏度85.25%，IGCA的灵敏度93.94%。结论 采用MALDI-TOF-MS联合WCX建立诊断模型能够有效区分各组病变，对高发区自然人群初筛工作有一定的应用临床价值。推测贲门癌的发生起始于LGIN或更早，但并不是所有的LGIN均发生癌变。对于表达与肿瘤相关差异蛋白峰的个体，需要给予内镜等干预措施。质谱技术为高发区早期癌及癌前病变初筛及肿瘤发生学研究提供一条新的思路。

关键词：贲门癌；癌前病变；MALDI-TOF-MS；蛋白质组学

中图分类号：R735 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.23.020

文章编号：1006-1959（2018）23-0072-04

Abstract：Objective MALDI-TOF-MS technique was used to detect the relevant differentially expressed proteins in the serum of precardia and early cancer in high incidence areas， and ExPasy database was used to search the related differentially expressed protein peaks to explore the correlation between differentially expressed protein peaks and tumorgenesis. Methods 259 pathologically confirmed serum samples were collected from the high-incidence areas， including 53 LGIN group， 89 HGIN group， 60 IGCA group and 57 NOR group. Serum proteins were purified by weak-cation exchange nano-magnetic beads and detected by MALDI-TOF-MS mass spectrometry. Results There were 193 statistically significant differentially expressed protein peaks in the pathological changes group， NOR group and each group， among which the optimal diagnostic model was established by 15 differentially expressed protein peaks： 1025， 1190， 1212， 1315， 1547， 1561， 1612， 3452， 3518， 4485， 5527， 7992， 8712， 14063 and 33313. The specificity of this model for precancerous lesions and cancers of cardia was 100.00%， the sensitivity of LGIN was 100.00%， the sensitivity of HGIN was 85.25%， and the sensitivity of IGCA was 93.94%. Conclusion MALDI-TOF-MS combined with WCX in the establishment of a diagnostic model can effectively distinguish between the groups of lesions， and has certain clinical value for the screening of natural population in high incidence areas. It is speculated that the occurrence of cardia cancer begins at LGIN or earlier， but not all LGIN cancers occur. Endoscopic and other interventions should be given to individuals expressing differentially expressed tumor-related protein peaks. Mass spectrometry provides a new idea for the early screening and tumorigenesis of early and precancerous lesions in high incidence areas.

Key words：Cardia cancer；Precancerous lesions；MALDI-TOF-MS；Proteomics

贲门癌（cardia cancer）是常见恶性肿瘤之一，近年来全球远端胃癌发病呈下降趋势，但是贲门癌的发病却不断上升[1]，目前其检出方式主要依赖于内镜检查，由于属于侵入性诊疗方式，而且其对内镜医生技术要求较高，难以用于与自然人群大规模普查，所以寻找特异性肿瘤标志物，以缩小内镜筛查范围，是目前所要解决的首要问题。而传统的肿瘤标志物多存在特异性、敏感性低等缺点，难以广泛应用于临床，因此，寻找新的特异性肿瘤标志物显得尤为重要。质谱技术是蛋白质组学研究的主要技术之一，具高通量、高灵敏度、高特异性等传统技术所不具备的优点，能够高效的检测组织、体液微量样本中的肿瘤相关低丰度蛋白。在众多质谱中，MALDI已广泛用于肝癌[2]、食管癌[3]、前列腺癌[4]肿瘤蛋白分子研究，本研究应用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）结合WCX磁珠技术平台，检测来自食管癌高发区内镜普查及活检组织病理学证实的贲门腺上皮低级别上皮内瘤变（low-grade intra pithelial neoplasia，LGIN）、高级别上皮内瘤变（high-grade intra epithelial neoplasia-intramucosal carcinoma，HGIN）、贲门癌（invasive gastric cardia adenocarcinoma，IGCA）和正常对照（Normal control，NOR），试图为肿瘤高发区早期贲门癌及高级别上皮内瘤变诊断与临床筛查探索一种新方法。

1资料与方法

1.1一般资料 血清样本取自2010年～2011年河北磁县、涉县肿瘤内镜筛查人群及河北医科大学第四医院内镜科来自高发区人群，NOR组取自同期该地区行内镜筛查的健康人群。本实验共收集标本259例，其中NOR组57例，LGIN组53例，HGIN组89例，IGCA组60例，进展期贲门癌患者采血前均未经放疗及化疗，所有标本排除肝炎、急性感染、自身免疫性疾病等影响血清蛋白表达的疾病。NOR组男性41例，女性16例，年龄43～76岁，平均年龄（58.70±7.26）岁。LGIN组男性49例，女性4例，年龄45～71岁，平均年龄（57.57±7.02）岁。HGIN组男性71例，女18例，年龄46～74岁，平均年龄（58.80±7.49）岁。IGCA组男性50例，女性10例，年龄45～75岁，平均年龄（61.22±7.74）岁。所有患者均经病理学证实。随机筛选156例标本作为训练组，包括NOR组33例、LGIN组29例、HGIN组61例、IGCA组33例。剩余103例标本作为盲法验证组，包括NOR组24例、LGIN组24例、HGIN组28例、IGCA组27例。

1.2实验方法

1.2.1样本采集 每例样本取材包括空腹静脉血、病史（吸烟、饮酒、家族史、既往史）、知情同意书，检查对象均排除急性感染、过敏、肝病、自身免疫性疾病等影响血清蛋白质表达的疾病。

1.2.2样品测定 质谱仪参数设置及数据采用MALDI（Biorad PBSⅡc）质谱仪对制备好的样品进行质谱分析，采用激光源强度为240，加速源电压为20000 V，检测器灵敏度为8，真空度为8.387e-007 Torr，扫描质量范围为0～50000 Da，收集次数为112次/每点，用Ciphergen Protein Chip软件收集数据。

1.3统计学分析 所有数据经SPSS l6.0统计软件包处理，对各组进行正态性检验（P>0.1）、满足正态性的蛋白进行ANOVA检验，不满足条件的蛋白峰行非参数Kruskal-Wallis H test检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。用Biomarker Wizard TM和Biomarker Patterns TM Software软件进行数据分析，在整个质谱图中定量标定出代表每种蛋白的波峰。

2结果

2.1建立贲门癌高级别上皮内瘤变及粘膜内癌诊断模型 应用MB-WCX联合MALDI-TOF-MS对样本进行检测，并进行统计学处理。随机筛选其中156例样本在低质荷比范围（0～50000 m/z）范围内检测，在1000～50000 m/z内全部可识别的差异蛋白峰有235个，共有统计学差异的蛋白峰193个（P<0.05）。

2.2利用BPS5.0建立指纹图谱模型 用BPS分析这些差异蛋白，构成诊断模型的15个蛋白峰分别为1025、1190、1212、1315、1547、1561、1612、3452、3518、4485、5527、7992、8712、14063、33313。各峰强度及P值，见表1。

2.3诊断模型的灵敏度及特异性 应用产生树形模型的源数据对该模型进行的性能判断，即对该模型学习能力的判断。该模型检验建立样本所用的156例源数据，该模型对贲门癌前病变及癌的特异性为100.00%（33/33），LGIN的灵敏度100.00%（29/29），HGIN的灵敏度85.25%（52/61），IGCA的灵敏度93.94%（31/33）。为了验证上述模型的灵敏度和特异性，对该模型进行盲法测试。扩大样本量，对未知的103例血清标本进行盲法预测，验证结果表明，对该模型对贲门癌前病变及癌的特异性为100.00%（24/24），LGIN的灵敏度100.00%（24/24），HGIN的灵敏度92.86%（26/28），IGCA的灵敏度92.59%（25/27），见表2。

3讨论

MALDI-TOF-MS是近几年来发展起来的一种新型软电离有机质谱技术，其基本原理是将被测物分散在基质分子当中形成晶体，当用一定强度的激光照射时，基质分子从辐射中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，然后对结合蛋白质进行质谱测定[5，6]。我们[7]已應用MALDI技术对高发区食管癌及正常对照组血清进行检测，发现大量差异蛋白峰，对于早期食管癌及前病变的特异性为90.91%（30/33），对LGIN的灵敏度为100.00%（31/31），HGIN灵敏度为89.66%（52/58），AEC的灵敏度为81.26%（26/32）。Zhu D等[8]采用MALDI-TOF-MS对结肠癌患者血清进行分析，在训练组中敏感性及特异性均为100.0%，在测试组中的敏感性为94.4%，特异性为75.5%。我们采用WCX结合MALDI-TOF-MS对容易获得的血清标本进行纯化分析，经统计学处理后各组间存在统计学差异的蛋白峰有194个。输入BPS建立诊断模型，由15个蛋白峰组成的诊断模型该模型对贲门癌前病变及癌的特异性为100.00%（33/33），LGIN的灵敏度100.00%（29/29），HGIN的灵敏度85.246%（52/61），IGCA 的灵敏度93.93%（31/33）。另选103例血清标本进行盲法预测，验证结果表明，该模型对该模型对贲门癌前病变及癌的特异性为100.00%（24/24），LGIN的灵敏度100.00%（24/24），HGIN的灵敏度92.86%（26/28），IGCA的灵敏度92.59%（25/27）。该诊断模型能够很好区分贲门癌发生过程的每个时期，而且取材简单方便、操作快捷，简便易行，自动化程度高，5 min内完成分析。方便用于贲门癌高发区自然人群初筛，降低内镜对大规模人群筛查的成本。

目前对于贲门癌发生的多阶段演进过程分子机制尚不清楚，本研究对BPS建模筛选出来的差异蛋白峰进一步分析，其中1561、1612、7992、14063、1547、33313均自LGIN至IGCA呈高表达，1212、4485自LGIN至IGCA组均呈低表达，5527蛋白在高级别上皮内开始升高，在浸润癌与HGIN组间差异无统计学意义（P<0.05）。说明贲门癌发生过程中在LGIN时期一些与肿瘤相关的蛋白可能已发生改变，且与中晚期癌的变化无明显差异。Yang J等[9]采用MALDI-TOF-MS及液相色谱技术发现正常对照组与胃癌患者之间存在49种差异蛋白，非转移患者與转移患者之间存在19种差异蛋白。因此，质谱技术的应用使得我们发现更多与肿瘤相关未知蛋白，对于肿瘤的发生、发展研究具有一定的帮助。

综上所述，在癌前病变时期部分蛋白分子已经发生改变，对寻找贲门癌及癌前病变的肿瘤标志物具有重要意义，对于大量未知蛋白，我们有必要下一步准备对差异蛋白质荷比峰进行分离、纯化鉴定，将会进一步增加本实验模型临床应用的可行性，同时也为筛选贲门癌新的肿瘤标志物奠定基础。

参考文献：

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[7]陈仙梅，袁丽，郭硕，等.高发区早期食管癌及癌前病变血清蛋白研究[J].中华临床医师杂志（电子版），2014，8（19）：3416-3421.

[8]Zhu D，Wang J，Ren L，et al.Serum proteomic profiling for the early diagnosis of colorectal cancer[J].J Cell Biochem，2013，114（2）：448-455.

[9]Yang J，Song YC，Dang CX，et al.Identification of serum proteome signatures of locally advanced and metastatic gastric cancer：a pilot study[J].J Transl Med，2015，13（304）：1-11.

收稿日期：2018-9-12；修回日期：2018-9-20

编辑/雷华