单核细胞增生李斯特菌LadR蛋白对外排泵MdrL的调控机制研究

徐雅梦 姜晓冰 于涛

（1. 河南师范大学生命科学学院，新乡 453007；2. 新乡学院生命科学技术学院，新乡 453003）

单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）是一种重要的食源性致病菌，该菌在自然界分布广泛，易对熟肉制品、乳制品、海产品和蔬菜等食品造成污染。摄入被Lm污染的食品可引起李斯特菌病（Listeriosis）的爆发和流行［1］。老人、孕妇、新生儿以及免疫力低下者是李斯特菌病的易感人群，临床症状主要表现为败血症、脑膜炎、孕妇流产等［2］。李斯特菌病在全球范围内的发病率较低，但是其致死率却高达25.9%［3］，严重威胁人类的健康。为了防止食品被致病菌污染，食品企业通常使用消毒剂来抑制或杀灭食品加工环境中的微生物。苯扎氯铵（Benzalkonium chloride，BC）属于季铵盐类消毒剂，被广泛应用于食品工业领域。BC的长期使用可能会促使耐药菌株的出现，影响其消毒效果。

许多文献报道，从食品加工环境和市售食品中分离的Lm菌株对BC敏感性下降［4-6］。目前研究者普遍认为外排泵是介导Lm对BC耐受的主要机制。外排泵属于膜转运蛋白，在细菌中广泛存在。除了参与细胞的正常物质运输和代谢，外排泵还能够去除细菌细胞和胞膜中的有害物质，帮助细菌抵御外界不良环境的影响［7］。研究报道，一些外排泵可将抗生素、消毒剂、重金属等作为底物排出菌体外使细菌产生耐药性［8］。我们先前的研究发现，主要易化子超家族（Major facilitator superfamily，MFS）外排泵MdrL在Lm对BC耐受中起作用。根据Lm全基因组序列可知，ladR基因反向位于mdrL外排泵基因的上游，编码的LadR蛋白由176个氨基酸分子组成，属于PadR转录负调控蛋白家族。Huillet等［9］推测，mdrL基因的启动子区域可能存在调控蛋白LadR的结合位点，但这一推测并没有被进一步证实。本研究以Lm标准菌株EGD-e为研究对象，利用同源重组技术［10］构建ladR基因缺失菌株ΔladR，通过实时荧光定量PCR（Quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction，qRT-PCR）、凝胶阻滞试验（Electrophoretic mobility shift assay，EMSA）等调查LadR蛋白对外排泵MdrL的调控作用及调控方式。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及质粒 Lm标准菌株EGD-e由华中师范大学罗勤教授惠赠；穿梭质粒pMAD和表达载体pET32a由本实验室保存；大肠杆菌DH5α和BL21（DE3）感受态细胞购自北京博迈德基因技术有限公司。

1.1.2 培养基及主要试剂 脑心浸液培养基（Brain Heart Infusion，BHI），购自北京陆桥生物技术有限公司；苯扎氯铵，购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；细菌基因组DNA提取试剂盒和质粒小提试剂盒，购自北京天根生化科技有限公司；胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒、T4连接酶、限制性内切酶，购自美国Thermo Fisher；TaqDNA聚合酶和dNTP，购自大连宝生物工程有限公司；His标签蛋白纯化试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒、EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5×），购自碧云天生物技术研究所；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.1.3 仪器与设备 DH360型电热恒温培养箱，北京科伟永兴仪器有限公司；THZ-82气浴恒温振荡器，金坛天竟实验仪器厂；TGL-16B型离心机，上海安亭科学仪器厂；ETC811型基因扩增仪，北京东胜创新生物科技有限公司；DYY-8C型电泳仪，北京市六一仪器厂；LightCycler@96实时荧光定量PCR仪，瑞士Roche；UNIVERSAL HOOD II 凝胶成像分析系统、Gene PulserXcellTM电转仪，美国 Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1ladR基因缺失突变株的构建与分子鉴定 以EGD-e基因组DNA为模板，分别用1408-1/1408-2和1408-3/1408-4两对引物扩增ladR基因的上下游同源臂，引物序列见表1。利用重叠延伸PCR（Splicing by Overlap Extension，SOE-PCR） 技 术［11］融 合 上下游同源臂，融合片段经切胶回收后与穿梭载体pMAD分别用限制性内切酶BamH I和MluI进行同步双酶切。酶切产物经纯化后进行连接反应，将构建好的重组质粒pMAD-ΔladR转化至大肠杆菌DH5α中，将阳性转化株送至北京博迈德基因技术有限公司进行测序。

采用青霉素G法制备EGD-e感受态细胞［12］。将测序正确的重组质粒pMAD-ΔladR与EGD-e感受态细胞混匀，电击后立刻加入500 μL BHI培养基于30℃培养3 h。将菌液均匀涂布于含红霉素（5 μg/mL）、和X-gal的BHI平板上，30℃培养48 h。挑取蓝色单菌落于含红霉素（5 μg/mL）的BHI液体培养基，39℃培养24 h。稀释菌液选择合适梯度的稀释液涂布于含红霉素（5 μg/mL）和X-gal的BHI平板上，39℃培养48 h。挑取蓝色单菌落于BHI液体培养基，30℃培养24 h。将菌液转接至新鲜的BHI，39℃培养。稀释菌液选择合适梯度的稀释液涂布于含X-gal的BHI平板上，39℃培养48 h。挑取白色单菌落用引物1408-1和1408-4进行PCR扩增检测缺失条带，最终获得ΔladR突变株。

表1 PCR扩增所用引物

1.2.2mdrL基因转录水平检测 将野生株EGD-e和突变株ΔladR分别接种至BHI中（各6管），37℃振荡培养至OD600nm≈0.6。将菌株平均分为两组，第一组为不加任何药物（作为对照组），第二组为加入BC（2 μg/mL），37℃继续培养30 min。立即加入10%的反应终止液（苯酚∶无水乙醇=1∶9）［13］，冰上放置10 min。

按照细菌RNA提取试剂盒的使用说明提取细菌总RNA，测定RNA的浓度和纯度后用于后续试验。利用cDNA第一链合成试剂盒将RNA反转录为cDNA，-20℃保存备用。根据GenBank的基因序列设计靶基因mdrL和参照基因16S rRNA的引物（表2）。以cDNA作为模板，使用RealMasterMix（SYBR Green）试剂盒进行 qRT-PCR。采用 ΔΔCT法［14］进行目的基因表达量的分析。

1.2.3ladR基因的克隆 以EGD-e的基因组DNA作为扩增模板，用引物ladR-q1和ladR-q2（表1）扩增ladR全基因序列。ladR扩增产物与表达载体pET32a分别用限制性内切酶BamH I和XhoI进行同步双酶切，酶切后的产物经纯化后进行连接反应，将构建好的重组表达载体pET32a-ladR转化至大肠杆菌BL21（DE3），挑选阳性转化株送至北京博迈德公司测序。

1.2.4 LadR蛋白的表达与纯化 将LadR蛋白表达菌株接种于5 mL含Amp（100 μg/mL）的LB液体培养基，37℃过夜培养。过夜培养物按1∶100分别接种至50 mL含Amp（100 μg/mL）的LB液体培养基，37℃振荡培养至OD600nm≈0.6。将菌液分两组，一组不做任何处理，另一组加入终浓度为0.5 mmol/L［15］的 IPTG，37℃ 继 续 培 养 8 h。 离 心（4 000×g，5 min）收集细胞。按照His标签蛋白纯化试剂盒的步骤提取纯化重组蛋白His6-LadR。取10 μL纯化蛋白进行SDS聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）［16］。利用 BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定重组蛋白His6-LadR的浓度。

1.2.5 凝胶阻滞试验 利用引物pmdrL-F/pmdrL-R扩增mdrL的启动子区域，同时随机挑选一段编码区DNA（recA）作为阴性对照。将纯化后的DNA（200 ng）与纯化后的重组蛋白His6-LadR在EMSA/Gel-Shift结合缓冲液中混合，室温放置20 min。利用6%非变性PAGE电泳进行结合活性检测［17］。

2 结果

2.1 ladR基因缺失菌株的构建与分子鉴定

用引物1408-1/1408-2扩增得到ladR基因上游同源臂480 bp，用引物1408-3/1408-4扩增ladR下游同源臂168 bp。通过SOE-PCR得到648 bp的上、下游同源臂融合片段ΔladR，条带均与预期结果一致（图1-A）。融合片段ΔladR与穿梭质粒pMAD连接获得重组质粒pMAD-ΔladR。双酶切验证结果如图1-B。

测序正确的重组质粒pMAD-ΔladR电转至EGD-e感受态。筛选得到的阳性菌株用检测引物1408-1/1408-4只能扩增出648 bp的片段（图1-C）。测序结果表明已成功缺失ladR基因，获得ΔladR突变株。

图1 ladR基因缺失株的构建

2.2 mdrL基因转录水平分析

由图2可明显看出，与野生株相比，突变株ΔladR的mdrL基因的转录水平提高约51倍。BC胁迫下，野生株EGD-e的mdrL基因转录水平提高约1.6倍，突变株ΔladR的mdrL基因的转录水平约1.4倍。该结果表明LadR对mdrL基因有负调控作用。

图2 qRT-PCR检测mdrL基因转录水平

2.3 ladR基因的克隆

以EGD-e基因组DNA为模板扩增得到长度为525 bp的ladR全基因片段（图3）；构建得到的重组质粒pET32a-ladR经双酶切验证及测序，验证结果一致表明已成功获得表达菌BL21（DE3）-ladR。

图3 表达菌BL21（DE3）-ladR的构建

2.4 LadR蛋白的表达及纯化

IPTG诱导后，表达宿主菌在35 kD附近出现一条明显的蛋白条带，与预期的蛋白分子量大小（36.5 kD）十分相近（图4），表明目的蛋白在宿主菌已得到成功表达。利用His标签蛋白纯化试剂盒处理后可以得到高纯度的His6-LadR蛋白；经BCA蛋白浓度测定试剂盒测定可知其浓度为1 mg/mL。

M：蛋白maker；1：纯化蛋白；2：阴性对照；3～5：IPTG诱导

2.5 凝胶阻滞试验

EMSA结果（图5-A）显示，LadR蛋白可与mdrL基因启动子区域结合，并且该结合作用在一定范围内随LadR蛋白浓度升高而增强；而在所有蛋白浓度下，阴性对照recA基因均未出现阻滞条带（图5-B）。结果表明，LadR蛋白可与mdrL启动子序列发生特异性结合作用。

图5 重组蛋白His6-LadR与启动子区域结合活性

3 讨论

Tamburro等［18］研究报道，BC胁迫下mdrL基因出现明显过表达现象，推测MdrL外排泵在Lm对BC耐受中起作用。Romanov等［19-20］通过检测不同Lm菌株中mdrL基因的表达量发现，BC胁迫下mdrL基因的转录水平升高4-20倍，该结果表明在BC刺激下不同菌株的mdrL基因表达量呈现差异性。我们先前的研究结果显示，与野生株EGD-e相比，mdrL基因缺失突变株ΔmdrL在亚致死浓度BC胁迫下的生长迟滞期延长、平均最大生长率和平均最大光密度值均降低；在致死浓度BC作用下的存活率降低2个log值，表明MdrL外排泵在Lm对BC耐受中起作用。本研究结果显示，BC作用下，mdrL基因在野生株EGD-e中的转录水平提高约1.6倍，表明BC能够诱导mdrL基因的表达。不过，与前人的研究结果相比，本研究中mdrL基因转录水平升高的倍数较低。其原因可能有三点：一是菌株自身的差异性；二是BC刺激的时期不同；三是BC作用的浓度不同。

Huillet等［9］利用 Northern blot技术检测mdrL基因的表达水平，结果发现LadR蛋白对mdrL基因具有负调控作用，并推测在正常生长条件下（BHI培养基），LadR与mdrL基因的启动子区域结合，从而抑制mdrL外排泵基因的转录。本论文在前人研究的基础上，深入调查LadR蛋白对MdrL外排泵的调控机制。qRT-PCR结果显示，无BC刺激时，mdrL基因在ladR基因缺失突变株中的转录水平比野生株EGD-e高51倍，表明LadR蛋白可能负调控mdrL基因的转录；BC作用下，mdrL基因在突变株中的转录水平比EGD-e高1.4倍，我们推测在BC胁迫下，除了LadR蛋白可能还存在其他的调控蛋白参与mdrL的调控。EMSA试验［21］结果显示，LadR蛋白能够与mdrL基因启动子区域结合，并且其结合活性随蛋白浓度的增加而增强，当蛋白浓度大于0.4 mg/mL时，结合活性没有明显变化。LadR蛋白与recA基因的编码区没有发生结合作用，表明LadR与mdrL基因启动子区域的结合具有特异性。

4 结论

本研究以Lm标准菌株EGD-e为研究对象，深入调查LadR对MdrL外排泵的调控作用及其调控方式。结果表明，BC能够诱导mdrL基因的表达。LadR蛋白负调控mdrL基因的表达；在正常生长条件下，LadR与mdrL基因的启动子区域结合，抑制外排泵基因mdrL的表达。