壳聚糖基纳米纤维载药体系及其缓释行为

付译鋆， 安 琪， 张 伟， 张 瑜， 柯惠珍

(1. 南通大学 纺织服装学院， 江苏 南通 226019； 2. 安全防护用特种纤维复合材料研发国家地方联合工程研究中心， 江苏 南通 226019； 3. 福建省新型功能性纺织纤维及材料重点实验室(闽江学院)， 福建 福州 350108)

创面感染是阻碍伤口愈合的首要因素[1]，开放创面由于皮肤完整性遭到破坏，失去防御细菌的屏障，易造成局部感染，甚至引发全身感染，威胁患者生命。选择合适的载体材料，可控制抗菌药物的释放速度，延长有效浓度作用时间，提高药物疗效，降低毒副作用[2]，因此，研制具有缓释效果的抗菌材料对创伤治疗尤为重要。

壳聚糖(CS)是一种可生物降解的天然高分子，作为载体材料广泛应用于药物缓释系统[3-4]。同时，作为一种功能高分子材料，壳聚糖还具有良好的生物相容性、广谱抗菌性以及止血、促愈等多种生理活性作用[5]，因此，壳聚糖基缓释系统不仅可实现药物的控制释放，而且还具备优异的抗菌和促愈作用，是理想的创面敷料缓释载体材料。目前，常见的壳聚糖缓释系统主要包括壳聚糖缓释微球、纳米粒、微囊、水凝胶和缓释膜[6-7]。其中，壳聚糖缓释微球、纳米粒和微囊虽可获得较高的药物包封率和良好的缓释效果，但受剂型所限，并不能直接用作创面敷料；壳聚糖水凝胶具有独特的三维网络结构和良好的吸液特性，但用作创面敷料缺乏足够的力学性能；壳聚糖缓释膜虽具有良好的柔韧性和贴敷性，但透气性能欠佳，不能提供创面愈合所需的气体交换。

静电纺纳米纤维具有纤维直径细、比表面积大的结构特点[8]，作为缓释载体材料有利于药物的吸收与控制释放[9-10]。另外，静电纺纳米纤维膜独特的三维多孔物理结构和较高的孔隙率，既能够保证其与外界进行液体和气体交换，利于维持创面愈合所需的湿度与含氧量，同时，纳米级多孔结构又可实现对细菌的物理阻隔[11]。本文以环丙沙星为药物模型，采用静电纺丝技术制备载药壳聚糖基复合纳米纤维膜，探究纺丝体系、纺丝工艺对纤维膜结构与性能的影响，重点分析药物体外释放行为及抗菌性。

1 实验部分

1.1 原 料

壳聚糖(CS)，黏度为200 mPa·s，相对分子质量为10×104，南通市兴成有限公司；聚乙烯醇(PVA)，分析纯，上海臣启化工科技有限公司；冰乙酸，分析纯，质量分数为99.5%，天津市北辰方正试剂厂；环丙沙星，分析纯，有效成分为1-环丙基-6-氟-1,4-二氢-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-3-喹啉甲酸，回音必集团浙江亚东制药有限公司。

1.2 试样制备

1.2.1CS/PVA纺丝溶液的制备

常温下，将壳聚糖粉末溶于乙酸水溶液，聚乙烯醇粉末溶于蒸馏水中，搅拌均匀；然后将2种溶液按一定比例混合，在70 ℃下恒温搅拌均匀，制成 CS/PVA溶液，静置脱泡备用[12]。

1.2.2载药CS/PVA纺丝溶液的制备

室温条件下，称取一定量的环丙沙星粉末，溶于上述CS/PVA溶液中，配制成不同质量分数的载药CS/PVA纺丝溶液，搅拌均匀并静置脱泡。

1.2.3纤维膜的制备

将纺丝溶液倒入装有金属针头(内径为 0.98 mm)的注射器中进行静电纺丝。设置纺丝参数为：纺丝液质量分数2.5%，接收距离15 cm，给进速度0.9 mL/h，电压范围20～24 kV。纺丝环境为：温度(23±1)℃；相对湿度(35±5)%。

1.3 测试方法

1.3.1表面形貌观察

对纳米纤维膜进行喷金处理，采用S-3400N型扫描电子显微镜观察其表面微观形貌；随机选取100根纤维，利用Nano-Measurer软件测量其直径，结果记录为(平均值±标准差)。

1.3.2静态接触角测试

随机选取5处位置，采用JC2000C型接触角测量仪测试纳米纤维膜的静态接触角，结果取平均值并计算其标准差。

1.3.3化学结构测试

采用FT-IR650型傅里叶变换红外光谱仪，对不同纳米纤维膜的化学结构进行表征和比较。波数范围为4 000～500 cm-1。

1.3.4载药体外释放测试

采用GZX-GF-1001型紫外分光光度计，在λ=280 nm处测定不同质量分数环丙沙星溶液的吸光度，绘制药物标准曲线，得到药物标准曲线方程。测量不同时间点载药纳米纤维膜在PBS缓冲溶液中的吸光度，并根据药物标准曲线方程计算出对应的药物浓度，绘制环丙沙星体外释放曲线。

1.3.5抗菌性测试

参照GB/T 20944.1—2007《纺织品 抗菌性能的评价 第1部分：琼脂平皿扩散法》，测试载药前后CS/PVA复合纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌的抗菌效果。

2 结果与讨论

2.1 纤维膜表面微观形貌分析

2.1.1CS/PVA纳米纤维膜

2.1.1.1CS与PVA质量比对纤维形貌的影响 控制纺丝电压为24 kV，调整CS与PVA质量比分别为 1∶1、1∶1.5、1∶2，对CS与PVA纳米纤维膜微观形貌的影响如图1所示。可见，图1(a)、(b)中纤维光滑平直，成网良好，而图1(c)中发现大量珠结，且有纤维断裂现象。进一步分析CS与PVA质量比对纤维直径的影响，当CS与PVA质量比由 1∶1变为1∶1.5时，纤维平均直径由(56.73± 14.43)nm下降为(38.15±8.19)nm，变异系数由25.43%略降至21.46%；当CS与PVA质量比为 1∶2 时，纤维平均直径增大为(44.40±15.42)nm，且变异系数显著上升至34.73%，即随着PVA含量的提高，纤维平均直径先减小后增大，变异系数先下降后上升。综上可知，CS与PVA质量比为 1∶1.5 时，纤维形貌良好。

图1 不同CS/PVA质量比的纳米纤维膜扫描电镜照片(×30 000)Fig.1 SEM images of CS/PVA nanofiber membranes with different CS/PVA mass ratio (×30 000)

以上结果表明，纺丝液中PVA含量的提高，可在一定程度上改善CS的可纺性，但过量的PVA可能会降低溶液黏度，影响纤维成网。这是因为PVA溶液黏度小于CS溶液，过量的PVA会使体系黏度降低过大，难以在电场力作用下牵拉成丝。

2.1.1.2纺丝电压对纤维形貌的影响 控制CS与PVA质量比为1∶1.5，调整纺丝电压分别为20、22、24 kV，对CS/PVA纳米纤维膜微观形貌的影响如图2 所示。可以看出，图2(a)、(b)中纤维有轻微串珠结构和黏连现象，而图2(c)纤维表面光滑，粗细均匀，整体形貌良好。

进一步分析纺丝电压对纤维直径的影响，当纺丝电压从20 kV增加到24 kV时，CS/PVA纳米纤维膜的纤维平均直径从(57.05±12.03)nm下降至(38.15±8.19)nm。这是因为随着纺丝电压的增大，射流携带电荷量增加，库仑力变大加剧射流在电场中的鞭动，进而增加射流所受的牵伸力，导致纤维膜中纤维直径降低。由此可知，最佳纺丝电压为24 kV。

图3 不同环丙沙星质量分数下载药CS/PVA纳米纤维膜的扫描电镜照片(×20 000)Fig.3 SEM images of drug loaded CS/PVA nanofiber membranes with different ciprofloxacin concentration (×20 000)

2.1.2载药CS/PVA纳米纤维膜

控制CS与PVA质量比为1∶1.5，纺丝电压为 24 kV，调整环丙沙星质量分数分别为1%、2%、3%，载药壳聚糖纳米纤维膜的微观形貌及纤维直径如图3所示。

由图3(a)可知，纤维连续平滑，平均直径为(63.16±8.61)nm，而从图3(b)、(c)中观察到纤维黏连和大量不规则珠结，且纤维直径有所增大。一方面，环丙沙星的加入改变了纺丝液的黏度，影响了纤维网形貌[13]；另一方面，环丙沙星在水中溶解度较低，质量分数过高会使环丙沙星以晶体形式从纺丝液中析出[14]。

2.2 CS/PVA纳米纤维膜亲水性分析

测试不同CS/PVA质量比纳米纤维膜接触角可知，纯PVA纳米纤维膜接触角为(51.20±2.86)°；CS与PVA 质量比分别为1∶1、1∶1.5、1∶2时，纳米纤维膜接触角分别为(85.40±2.07)°、(80.60±2.70)°、(74.80±2.39)°，即试样接触角随PVA含量增加而下降。采用单因素方差分析法(ANOVA)进行显著性分析，结果表明，与纯PVA纤维膜相比，3组不同CS/PVA质量比纳米纤维膜的接触角具有显著性差异(p≤0.001)。这是由于壳聚糖分子链段具有一定的疏水性，而随着PVA含量的增加，羟基数量不断增加[15]，故共混纤维膜接触角减小，亲水性得到改善。

2.3 纳米纤维膜结构分析

为更好分析纳米纤维膜表面化学结构，分别对PVA纳米纤维膜、CS/PVA纳米纤维膜、载药 CS/PVA 纳米纤维膜、环丙沙星粉末进行红外光谱测试，结果如图4所示。

图4 不同试样的红外光谱图Fig.4 FT-IR spectra of different samples

由图4可知，PVA纳米纤维膜的红外光谱在 3 346 cm-1处附近较宽的吸收带为—OH的伸缩振动，2 919 cm-1处的吸收峰归因于C—H的伸缩振动和面内弯曲振动，1 734 cm-1和1 434 cm-1处分别对应CO和OCOR的特征振动吸收峰，1 375 cm-1和 1 089 cm-1处为—CH2和 C—O—C 的弯曲振动[16-17]。

相比PVA纳米纤维膜，CS/PVA纳米纤维膜的红外光谱在3 300 cm-1附近特征吸收峰变宽且强度增加[18]，可归因于N—H与CS分子内氢键伸缩振动形成的重叠吸收峰[19]；同时，1 068、1 025 cm-1处出现新的肩峰为C—O的伸缩振动峰[20]，894 cm-1处出现CS中β构型糖苷键的特征吸收峰。以上结果表明，CS/PVA纳米纤维膜制备过程中，CS和PVA之间并非简单的混合，而是产生了新的氢键作用，使得部分氨基转变为NH3+，降低了氨基对纺丝的不良影响，改善了CS的可纺性。另外，CS与PVA分子间较强的相互作用，产生了一定程度的结构变化，使得二者在共混体系中表现出良好的相容性[21]。

与载药前CS/PVA纳米纤维膜相比，载药 CS/PVA纳米纤维膜的红外光谱在1 621、1 488、752 cm-1处分别出现3个新的吸收峰，对比环丙沙星药物粉末的红外光谱可知，这3处为环丙沙星特征吸收峰，表明载药CS/PVA纳米纤维膜中成功保留了环丙沙星的部分结构。另外，载药后的纤维膜在 1 380、1 267、1 068、1 025 cm-1处的峰强显著增加，且酰胺基的吸收振动峰由载药前的1 558 cm-1移动到高波数1 575 cm-1处。分析原因可能是，药物分子与PVA分子间产生新的氢键或分子间斥力增加[22]。

2.4 载药CS/PVS纳米纤维膜体外释放分析

2.4.1标准曲线的绘制

称取环丙沙星0.1 g，用PBS缓冲溶液溶解并稀释至100 mL，制成1 000 μg/mL储备液。再将储备液稀释成50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL不同质量浓度的系列溶液。利用紫外分光光度计在λ= 280 nm处测得溶液吸光度并进行线性回归拟合，得到环丙沙星标准吸收方程为y=0.100 53x(R2=0.999 84)，标准曲线如图5所示。

图5 环丙沙星在PBS缓冲溶液中的标准曲线Fig.5 Standard curve of ciprofloxacin in PBS buffer

2.4.2体外释放分析

取载药CS/PVA纳米纤维膜50 mg于离心管中，加入PBS缓冲溶液8 mL，密封置于37 ℃的恒温振荡器中模拟体外释放过程，分别在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、24、48、72、96、120 h取出1 mL溶液，并补充等量PBS缓冲溶液。测定不同时间点溶液中药物浓度，计算药物累积释放率，并绘制药物累积释放率曲线，计算公式[23]为

Qn=CnV+Vi∑n-ii=0CiM0×100%

式中：Qn为第n个时间点药物累积释放率，%；Cn为第n个试样的药物浓度，mg/mL；V为释放介质体积，mL；Vi为第i个时间点取样体积，mL；M0为纳米纤维膜中药物质量，mg。

不同环丙沙星质量分数下载药CS/PVA纳米纤维膜的体外药物释放曲线如图6所示。可以看出，不同药物含量下释放曲线的变化趋势基本一致，随着时间的累积，药物释放率逐渐增大，并趋于平缓。不同载药纳米纤维膜起初2 h的累积释放率分别为15.93%、16.45%、17.47%，释放初期具有相对较低的速率，可有效避免药物突释；当持续释放120 h时，3个试样的累积释放率分别达到81.94%、85.90%、90.68%。同一时刻，药物释放速率随纤维膜中环丙沙星质量分数的增大而增大，这是由于药物含量的增加，提高了释放体系中的浓度梯度，更利于药物在介质中的扩散[24]。

图6 不同环丙沙星质量分数下载药CS/PVA纳米纤维膜的体外药物释放曲线Fig.6 In vitro drug release curves of drug loaded CS/PVA nanofiber membranes with different ciprofloxacin concentration

2.5 抗菌性分析

载药前后CS/PVA纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌的抗菌结果如图7所示。

1—载药前CS/PVA纳米纤维膜； 2—铝箔空白对照；3—载药CS/PVA纳米纤维膜； 4—铝箔空白对照。图7 载药前后CS/PVA纳米纤维膜的抗菌性Fig.7 Antibacterial properties of CS/PVA nanofibers before (a) and after (b) drug loading

由图7可以看出：铝箔空白对照周围不见抑菌圈，其不具有抗菌性；载药前CS/PVA纳米纤维膜具有极微小的抑菌圈，抗菌效果并不明显，分析原因可能是纤维膜中壳聚糖含量过低；而载药后，纳米纤维膜周围出现不规则形状抑菌圈，且抑菌圈直径显著增加，表明载药CS/PVA纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌具有优良的抗菌性。

3 结 论

以环丙沙星为药物模型，采用静电纺丝技术制备载药壳聚糖基复合纳米纤维膜，探究纺丝体系、纺丝工艺对纤维膜结构、性能的影响，分析药物体外释放行为及载药前后试样抗菌性。

1)随着PVA含量的提高，纳米纤维膜中纤维平均直径先减小后增大，变异系数先下降后上升；纤维膜接触角减小，亲水性得到改善，PVA的加入可在一定程度上改善CS的可纺性。

2)CS/PVA纳米纤维膜的平均直径随纺丝电压的增大而减小，当纺丝电压为24 kV、溶液质量分数为2.5%、给进速率为0.9 mL/h、接收距离为 15 cm、CS/PVA质量比为1∶1.5时，纤维膜成网均匀，形貌良好。

3)环丙沙星的加入一定程度上影响了纤维网形貌，载药纳米纤维膜起初具有相对较低的释放速率，可有效避免药物突释，且药物释放速率随纤维膜中环丙沙星质量分数的增大而增大。

4)抗菌实验结果表明，载药CS/PVA纳米纤维膜对金黄色葡萄球菌具有优良的抗菌性。

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