耐盐促生菌株B7的筛选及其在黄瓜上的应用

钱兰华 李婧 王桃云

摘要 本文综述了一种提高作物耐盐能力促生菌的筛选及其应用。通过对沿海滩涂盐碱地土壤中的微生物进行分离纯化，并采用耐盐和解盐试验对分离纯化出的根际微生物进行耐盐促生筛选，得到高耐盐活性促生菌B7。对B7的16S rDNA、生理生化性质及促生能力进行测定，最后采用培养皿法和盆栽法对B7提高黄瓜耐盐能力进行测试。结果表明，该菌株耐盐度为6%，利用B7制备的微生物菌剂能在盐胁迫下显著提高黄瓜的耐盐能力，减缓盐害现象，增加生物量，达到促进黄瓜生长的效果。

关键词 促生菌；耐盐能力；耐盐菌株B7；黄瓜

中图分类号 S156.4 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2018）19-0122-03

随着社会的发展和人口的增加，人们对耕地资源的需求也越来越多。土壤盐渍化是指土壤底层或地下水的盐分随毛管水上升到地表，水分蒸发后，使盐分积累在表层土壤中的过程；易溶性盐分在土壤表层积累的现象或过程，也称盐渍化。除滨海地区由于受海水浸渍影响而发生盐碱化外，干旱和半干旱地区发展设施农业也是引起土壤次生盐渍化的重要原因[1-2]。土壤盐渍化是当前威胁全球农业生产和农作物产量的主要非生物胁迫因子之一。目前，全球有50%的灌溉土地受到不同程度的盐胁迫，中国盐渍土（或称盐碱土）的分布范围广、面积大、类型多，总面积約1亿hm2，而且威胁面积逐年增加。如何改良和利用大面积盐渍化土地，以及保护并提高重要经济作物抵抗盐胁迫的能力是当今国际社会亟待解决的重要科技问题[3-5]。目前，主要生物改良方法有培育并种植耐盐碱作物，如种植高粱、甜菜、向日葵以及耐盐植物柽柳、沙蓬草、紫穗槐等；此外，还有对耐盐转基因植物的研究，但该类方法周期长、花费大，且未被社会广泛接受和认可。

根际微生物是指在植物根系土壤范围内生长繁殖的细菌、放线菌、真菌等微生物。大多数根际微生物对植物无害或对植物生长有促进作用，部分微生物还具有固氮、溶磷、产生植物生长激素和铁载体以及诱导植物抗性的功能。利用根际微生物提高盐碱地作物耐盐促生的方法具有投资少、见效快、效益高等特点。因此，有关根际微生物耐盐促生的功能活性研究已经受到研究者的广泛关注。从沿海滩涂土壤中分离筛选耐盐性菌株，可用于提高作物耐盐能力，同时可为耐盐基因的克隆及转基因耐盐植物的构建奠定基础。本文综述了耐盐性促生菌株B7在盐胁迫中促进作物发芽和生长的应用及其微生物菌剂制备方法，以期为耐盐性促生菌株B7的应用研究提供参考。

1 土壤芽孢杆菌菌株B7

1.1 耐盐菌株的分离及筛选

2017年7月6日，从江苏盐城沿海滩涂的盐碱地土壤采集土样15份，各取土样1 g悬浮于100 mL无菌水中，并以此稀释至105倍。采用LB培养基进行筛选，利用NaCl浓度为2%、4%、6%、8%、10%的NA培养基逐级筛选耐盐菌株。用移液器分别取土壤稀释液0.1 mL涂布于2种培养基平板上，30 ℃培养2～3 d，选取在6%盐浓度下生长良好的菌落，经反复划线纯化后保存备用，筛选得到1株耐盐菌株B7。耐盐促生菌株B7具有耐盐促生活性，最适生长温度为30 ℃，菌落较小、白色、隆起、边缘整齐、表面光滑湿润、不透明，为好氧型化能异养菌。菌株B7的平板培养菌落如图1所示。

1.2 耐盐菌株B7的鉴定

1.2.1 细菌分子遗传学分类鉴定。以菌株B7的DNA为模板、16S rDNA通用引物为引物，对16S rDNA片段进行扩增。将扩增的片段直接进行序列测定。将测序的结果输入NCBI网站上的BLAST程序进行比对，结果显示，该菌株的16S rDNA序列与GenBank基因库中芽孢杆菌属Bacillus meg-aterium的16S rDNA序列同源度最高，同源率达到100%。通过DNAMAN6.0对GenBank中已有的芽孢杆菌属的16S rDNA序列进行遗传进化分析，结果显示，菌株B7的16S rDNA与Bacillus megaterium同源性最高。因此，可以初步判定该菌株为芽孢杆菌属的巨大芽孢杆菌。

1.2.2 生理生化测定。参考《常见细菌系统鉴定手册》，对耐盐菌株进行生理生化测定，初步鉴定为革兰氏阳性，吲哚反应阳性，能水解淀粉和葡萄糖，能液化明胶；伏-普试验反应阴性、甲基红反应阴性，硫化氢阴性，柠檬酸盐试验阴性。

根据上述对该菌株遗传特性和生理生化特性的测定结果，确定从盐碱地土壤中筛选到的耐盐性促生菌株B7为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）。

1.3 耐盐菌株B7的耐盐性分析

将分离纯化的耐盐菌株B7菌悬液，分别转接相同量到不同盐浓度的液体培养基中，在30 ℃、130 r/min条件下摇床培养，观察生长情况，24 h后测其在600 nm波长处的吸光值，以确定细菌耐盐程度。耐盐性结果如图2所示，可见耐盐菌株B7对氯化钠有较宽的适应范围，菌株在无盐情况下不发生自溶现象，在盐浓度达到6%情况下仍然可保持较高的菌体浓度，在0～6%的盐浓度下均可生长，最适盐浓度为4%～6%。

2 菌株应用试验

2.1 菌株菌悬液制备方法

挑取在LB固体平板生长48 h的耐盐菌株B7单菌落，接种于250 mL LB液体培养基中，在30 ℃、130 r/min条件下摇瓶培养48 h后，待菌体生长至对数生长期，放入无菌离心管中12 000 r/min离心10 min，弃上清，收集菌体，用无菌水洗涤菌体2次后，再用无菌水调节菌体的吸光值为0.5～0.6，作为生物菌剂。

2.2 黄瓜种子培养皿发芽试验

取适量未经处理的黄瓜种子放入烧杯中进行消毒灭菌，先用75%乙醇（没过种子）浸泡1 min，然后倒出乙醇溶液，再加入现配的0.1%氯化汞浸泡1 min，然后倒出氯化汞溶液，最后用无菌水清洗3次，备用。准备适量的培养皿，将脱脂棉平铺在培养皿底层，盖好后灭菌待用；配制200 mmol/L氯化钠溶液，灭菌后备用。试验设4个处理，分别为空白对照组、耐盐菌株组、盐胁迫组和盐胁迫+耐盐菌株组。其中，盐胁迫组、盐胁迫+耐盐菌株组加200 mmol/L NaCl溶液（没过脱脂棉），空白对照组和耐盐菌株组加蒸馏水，3次重复。每个培养皿中放入40个种子（空白对照组和盐胁迫组的种子用无菌水浸泡6 h，耐盐菌株组和盐胁迫+耐盐菌株组的种子用B7菌液浸泡6 h）。将上述已完成所有步骤的培养皿放入光照培养箱中25 ℃培养7 d（前3 d暗培养，后4 d 为12 h光照培养、12 h暗培养）。

试验结束后，记录黄瓜种子发芽率、鲜重和干重。试验结果如图3、表1所示。结果表明，耐盐菌株B7+盐胁迫处理组的种子发芽率、鲜重分别是盐胁迫组的1.25倍和1.23倍，说明耐盐菌株B7对黄瓜种子具有明显的耐盐促生作用。

2.3 黄瓜盆栽试验

将黄瓜种子用温水浸泡过夜后，先用75%乙醇（没过种子）浸泡1 min后倒出，再加入现配的0.1%氯化汞浸泡1 min后倒出，最后用已灭过菌的蒸馏水清洗3次，备用。用营养土与蛭石（体积比4∶1）混合配制盆栽基质，121 ℃灭菌1 h，冷却后装至栽培盆（10 cm×10 cm×10 cm）中，每盆装入200 g。分别设置空白对照（无盐胁迫）、盐胁迫和盐胁迫+B7菌株3个处理，其中盐胁迫+B7菌株处理的种子先用菌株B7菌液浸泡6 h、空白对照和盐胁迫处理的种子用灭菌水浸泡6 h，5次重复。每盆播入处理好的黄瓜种子3粒，然后空白组用无菌水浇灌、盐胁迫组和盐胁迫+B7菌株组用菌株B7菌液混合200 mmol/L NaCl溶液浇灌，每周浇灌1次，其余时间浇灌无菌水。出苗后，计算发芽率和出苗率；然后每盆保留1株幼苗，1个月后测定总根长、总投影面积、总根表面积、平均根系直径和根尖数等生长指标及葡萄糖、赖氨酸含量等生理指标（表2、3）。

3 植物耐盐促生剂的制备

挑取已在LB固体平板上生长48 h的耐盐菌株B7单菌落，接种于250 mL LB液体培养基中，在30 ℃、130 r/min条件下摇瓶培养48 h，待菌体生长至对数生长期，放入无菌离心管中12 000 r/min离心10 min，弃上清，收集菌体，用无菌水洗涤菌体2次后，无菌水调节菌体的吸光值为0.6，即得植物耐盐促生剂。

4 结语

本文综述了耐盐性促生菌株B7的分离、篩选、鉴定及耐盐性分析，通过遗传特性和生理生化特性测定，确定该菌株为巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）；通过耐盐度分析、盐胁迫条件下的黄瓜种子发芽及盆栽试验中对黄瓜的耐盐促生作用分析，表明该菌株耐盐度为6%，同时发现利用耐盐菌株B7制备的微生物菌剂能在盐胁迫下显著提高黄瓜耐盐能力，减缓盐害现象，增加生物量，达到促进黄瓜生长的效果，有助于提高黄瓜的耐盐性，减少化学肥料的使用。因此，该菌剂具有广泛的应用前景。

5 参考文献

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