超高效液相色谱—串联质谱法测定粮谷中16种常见农药残留

陈丽娜，刘春明，王 晶，王 强

(长春师范大学中心实验室，吉林长春 130032)

粮食是人们生活的必须食品，其安全性与人们的身体健康息息相关。粮谷在种植过程中，通常需要使用杀虫剂、杀菌剂、除草剂等农药来保证其质量和产量[1]。不合理的使用农药会造成农药超标，危害人们的健康。因此，各个国家都设置了严格的农药残留限量标准[2]。国际食品法典委员会(CAC)规定粮谷中最高农药残留限量(MRL)为0.02～20.0 mg·kg-1[3]。日本《食品农药残留肯定列表制度》规定除四种明确强调的农药外(MRL分别为1.00 mg·kg-1,0.2 mg·kg-1,0.02 mg·kg-1,1.00 mg·kg-1)，均按限量值0.01 mg·kg-1执行[4]。我国《食品安全国家标准》(GB 2763-2016)规定粮谷中最大残留限量范围为0.05～1.00 mg·kg-1 [5]。所以建立粮谷中农药残留量的快速测定方法对于保证粮谷质量、提高安全性具有重要作用。

目前粮谷的农药残留检测方法比较多。气相色谱—质谱法、液相色谱—质谱法的灵敏度高、选择性好，是应用最广泛的农药残留检测方法。气相色谱—质谱法主要应用于对弱极性和非极性农药进行检测，如有机氯类、有机磷类、拟除虫菊酯类等[6-7]；液相色谱—质谱法主要用于对极性、热不稳定性农药进行检测，如氨基甲酸酯类[8]。超高效液相色谱—串联质谱法是将超压高效液相色谱与三重四级杆质谱串联起来，既具备三重四级杆质谱的高选择性、高灵敏度的优势，又具有超压高效液相色谱分析速度快、分析效率高的特点，在农药残留检测方面具有很好的应用前景[9]。

前处理方法是农药残留检测过程影响检测结果的关键部分。近年来，粮谷中农药残留检测的前处理方法主要有固相萃取法[6]、凝胶净化色谱法[10]、加速溶剂萃取法[11]等，这些方法比较耗时、费力，且成本较高。贾玮通过改进实验条件，将QuEChERS法[7]用于农药残留分析，节省了时间和成本。

本文在QuEChERS方法的基础上，进一步优化实验条件，建立了可以用于测定4种粮谷中16种常用农药的前处理方法，并应用超高效液相色谱—串联质谱技术进行测定。该方法选择性好、灵敏度高、可以对实际样品进行分析。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

超高效液相色谱—三重四级杆质谱联用仪(Acquity Iclass,Xevo TQ-S,waters)；离心机(3-30K，Sigma)；超纯水系统(Milli-Q integral 3,Millipore)；氮吹仪(MD200-1，郑州宝晶科技有限公司)；超声波清洗器(KQ-50E，昆山市超声仪器有限公司)。

乙腈、甲醇(色谱纯，Fisher，美国)；甲酸、乙酸(色谱纯，阿拉丁)；N-丙基乙二胺(PSA)；C18与石墨化碳粉末(GCB)均购于Sigma；氯化钠(NaCl)、无水硫酸镁(MgSO4)均为分析纯，购自于北京化工厂；农药标准物质：纯度>95%均来自Dr.EhrenstorferGmbH公司；实验用水为经Milli-Q超纯水系统处理后的超纯水。

1.2 样品提取与净化

准确称取2.0 g样品于50 mL离心管中，加入20 μL 200 ng·mL-1D5-莠去津，再加入10 mL超纯水浸泡1 h后，超声波振荡萃取10 min；加入10 mL含0.1%乙酸的乙腈，涡旋振荡1 min；加入1 g NaCl与4 g无水MgSO4混合物，涡旋混匀1 min，在4000 r·min-1条件下离心5 min。取7 mL提取液，加入到含有混合吸附剂的离心管中(分散剂的添加量为：1050 mg无水MgSO4、210 mg PSA，350 mg C18、70 mg GCB)，涡旋混匀1 min，在4000 r·min-1的条件下离心10 min；取5 mL上层清液，在30℃下氮吹至近干，用10%甲醇溶液定容至1 mL，过0.22 μm滤膜，待UPLC-MS/MS检测。

1.3 色谱条件

ACQUITYTMUPLC BEH C18色谱柱(Waters)，流动相A：乙腈，B：0.01%甲酸；流速：0.3 mL·min-1；进样量：2 μL；柱温：30℃；梯度洗脱程序：0～0.5 min，10%A；0.5～2.0 min，10%A～50%A；2.0～7.0 min，50%A～80%A。

1.4 质谱条件

电离方式：ESI+，ESI-；扫描方式：多反应监测(MRM)；毛细管电压：3.00 KV；离子源温度：150℃；锥孔气流量：50 L·h-1；脱溶剂气：N2；脱溶剂气温度：500℃；脱溶剂气流量：1000 L·h-1。母离子、子离子、锥孔电压、碰撞能量等质谱参数见表1。

表1 16种农药及内标的多反应监测(MRM)参数

注：*为定量离子。

2 结果与讨论

2.1 UPLC-MS/MS条件的优化

为了使目标成分都能得到较好的分离，实验采用了耐压能力更强的超高效液相色柱。实验首先研究了乙腈和甲醇作为有机相的分离效果。甲醇作为有机相时，色谱柱压力较高且化合物的峰形比乙腈作为有机相时宽，洗脱时间相对较长，因此选用乙腈作为有机相。但在乙腈—纯水系统下，烯啶虫胺的色谱峰形较宽且灵敏度较低，向水中添加0.01%甲酸后色谱峰形得到改善。因此，最终的流动相为乙腈—0.01%甲酸水溶液，同时对洗脱程序进行了优化，洗脱梯度见1.3。以小米空白基质中16种农药的提取离子流图为例(图1)，其中托布津、氯噻啉、烯草酮、稻瘟灵加标浓度是2.0 μg·kg-1，其他化合物的加标浓度是1.0 μg·kg-1。

图1 小米空白基质中16种农药的提取离子流图

2.2 样品前处理条件的优化

常规的QuEChERS方法适用于含水量大于80%的样品。谷物类样品含水量通常小于10%，因此实验考虑加一部分水来满足QuEChERS方法对样品的要求。由于谷物类富含较多淀粉，不易渗透到植物组织中，因此，本文采用浸泡和超声振荡相结合的方式促进水分渗入。众多文献报道，当农药的种类较多、性质差异较大时，0.1%乙酸的乙腈的萃取效果要好于纯乙腈[12]，所以本文选择0.1%乙酸的乙腈作为提取溶剂。由于谷物的主要干扰类成分是蛋白质以及色素，所以根据吸附剂的性质和作用，选择PSA，GCB和C18混合物作为净化分散剂[13]。首先，固定C18为200 mg，GCB为70 mg，PSA的用量从175 mg增加到300 mg，考察PSA用量对回收率的影响，实验结果表明，PSA的用量对农药回收率影响不大。

然后，固定PSA的用量为210 mg，GCB的用量为70 mg，改变C18的用量，观察净化效果与回收率。结果如图2所示，多菌灵、三唑磷的回收率随C18用量的增加有降低趋势，其它农药几乎不受C18用量的影响。从净化效果看，当C18用量超过350 mg时，净化效果较好且回收率满足要求，因此，C18的用量选择350 mg。

图2 C18用量对回收率的影响

最后，固定PSA的用量为210 mg，C18的用量为350 mg，考察GCB的用量对净化效果和回收率的影响。实验结果见图3。丁草胺、多菌灵、三唑磷、三环唑的回收率随GCB用量的增加而递减，当GCB的用量为70 mg时净化效果好，且回收率满足要求。因此，选择70 mg的GCB用量作为最佳条件。

图3 GCB用量对回收率的影响

2.3 基质效应

分别用空白基质提取液和10%甲醇溶液配制农药的基质校准溶液和标准溶液，以各化合物的峰面积对标准系列浓度绘制基质校准曲线及溶剂标准曲线。基质效应(ME)数值用基质校准曲线的斜率与溶剂标准曲线斜率之比计算。烯草酮和托布津受到基质效应影响较强(ME范围为0.07～0.25)，丁草胺、多菌灵、吡虫啉、氯噻啉受到基质抑制效应稍弱(ME范围为0.49～0.80)，啶虫脒、嘧菌酯、氟虫腈、丙草胺、噻虫啉、噻虫嗪、三唑磷、三环唑受基质影响较小(ME范围为0.79～1.26)，说明本方法的净化效果较好。

2.4 线性关系和灵敏度

取适量农药标准品混合溶液，分别用大米、小米、绿豆、豇豆空白样品基质溶液配制成一系列浓度梯度的标准溶液，按照1.3及1.4的条件进行测定，以各组分相对内标的响应值为纵坐标，质量浓度为横坐标，进行线性回归分析。结果表明，16种农药线性关系良好，线性范围及线性关系见表2。采用标准加入法，在大米、小米、绿豆、豇豆空白样品中添加一定浓度的标准溶液进行测定，以定量离子对色谱峰信噪比S/N≥3对应的最低浓度为样品的检出限(LOD)，S/N≥10对应的最低浓度为定量限(LOQ)，得到16种农药的LOD和LOQ(表2)。

表2 16种农药的线性方程、线性范围和相关系数

2.5 准确度和精密度

准确称取2.0 g空白大米、小米、绿豆、豇豆样品，加入适量农药混合标准溶液。充分混匀，加标浓度分别为2.0、5.0、10.0 μg·kg-1，按本方法进行测定，每个浓度进行4次平行测定。结果表明，13种农药在大米中的加标回收率在83.75%～118.62%之间，相对标准偏差(RSD)为1.08%～14.27%；在小米中的加标回收率在83.04%～105.46%之间，RSD为1.10%～14.85%；在绿豆中的加标回收率在80.53%～113.70%之间，RSD为1.38%～14.17%；在豇豆中的加标回收率在80.22%～117.98%之间，RSD为1.29%～15.09%。本方法的准确度与精密度能满足粮谷中这13种农药残留分析的要求。此外，丁草胺的回收率范围在60.36%～106.75%之间，RSD为5.19%～28.01%，丙草胺的回收率范围在61.83%～113.47%之间，RSD为3.27%～27.14%，二者在低浓度时回收率较低，标准偏差较大。托布津在2.0 μg·kg-1的添加水平没有达到定量限，因此回收率的添加浓度从5.0 μg·kg-1起，此时回收率范围在66.60%～87.83%之间，RSD为9.03%～21.74%，当浓度增加时回收率与标准偏差都有改善，回收率范围在73.47%～87.85%之间，RSD为4.89%～9.69%。

2.6 实际样品分析

使用本方法分别对大米、小米、绿豆、豇豆样品(各三份)中的农药进行分析检测。仅一份豇豆样品中检测出啶虫脒和吡虫啉，浓度低于定量限，其他样品均未检测出待测农药。

3 结论

本文建立了4种粮谷中16种农药的QuEChERS-UPLC-MS/MS分析检测方法。考察了方法的线性范围、检出限、定量限、加标回收率及相对标准偏差。结果表明，该方法满足多种农药残留分析标准的要求，同时具有方便、快捷、省时、净化效果好、灵敏度高的特点，可用于这4种粮食中的农药多残留检测。