sikFBA4基因启动子的克隆及低温表达模式分析

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(农业生物技术重点实验室，石河子大学生命科学学院，新疆 石河子832000)

果糖-1,6-二磷酸醛缩酶(fructose-1,6-diphosphate, FBAase)存在于卡尔文循环(Calvin cycle)、糖异生(gluconeogenesis)、糖酵解(glycolysis)以及磷酸戊糖途径(pentose phosphate pathway)等生物体维持正常生命活动所需的代谢途径中，并在碳、氮代谢及糖代谢等过程中起着极为重要的作用[1]。光合数学建模的研究指出，果糖-1,6-二磷酸醛缩酶能够调控光合碳代谢的速率[2]。然而到目前为止，对于光合碳流量控制的研究还没有涉及温度的因素，实际上温度对光合酶活性的影响是最直接的。Brüggemann等[3]和Pérez-Torres等[4]的研究表明，来源于不同生境、不同遗传背景植物的酶，其动力学特性不同，来源于抗寒植物的酶具有更好的低温适应性。

新疆天山雪莲(Saussureainvolucrata)属菊科风毛菊属，生长在海拔2400～4100 m的雪线附近的高山草甸、高山冰碛石和流石滩石隙、悬崖峭壁石缝等处。那里气候多变，昼夜温差较大，最高月平均温3～5 ℃，最低月平均温-21～-19 ℃[5]，生长环境极其恶劣。而雪莲能在这种极端的环境下快速生长，表明雪莲具有极强的耐寒、抗辐射、抗缺氧的能力[6-7]。

启动子是位于结构基因5′端上游的一段DNA序列，能够与RNA聚合酶特异性地结合并起始功能基因的转录。启动子是基因表达调控的一个重要的组成部分，能够决定基因转录的起始、效率和时空特异性。在转基因植物研究中，组成型启动子已经被广泛地应用，但由于组成型启动子恒定而持续表达的特点，造成物质和能量的过度消耗和不必要的浪费，使转基因植物常表现出植株矮小，产量和品质下降等问题。诱导型启动子能够在不同的生境条件下对基因的表达进行精准的调控，从而避免基因过量表达而造成的生物体的失衡。因此，研究诱导型启动子在植物转基因中的应用具有重要的实践意义。

在实验过程中发现，定位于叶绿体的sikFBA4能够对低温胁迫做出敏感的响应。因此推测PsikFBA4可能具有在寒冷条件下诱导基因表达的功能。为进一步研究sikFBA4在天山雪莲中的低温调控机制，以天山雪莲为材料，采用Hi-Tail PCR[8]的方法分离sikFBA4的启动子序列，并验证其在冷诱导方面的功能，为冷胁迫下光合碳流量控制的研究工作奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

天山雪莲由石河子大学农业生物技术重点实验室组培繁殖；本氏烟(Nicotianabenthamiana)由石河子大学农业生物技术重点实验室组培繁殖。

1.2 方法

1.2.1实时荧光定量PCR反应与sikFBA4的表达量分析 利用本实验室天山雪莲组培苗，于2017年11月对莲叶座伸展至5叶期的天山雪莲幼苗进行低温处理，并以正常条件下(19 ℃)的雪莲组培幼苗作为对照，处理时间分别为1、3、6、12和24 h，每个处理进行3次重复。所有材料在处理后用液氮进行速冻并保存于-80 ℃冰箱备用。

根据已获得的sikFBA4基因的cDNA序列设计实时荧光定量引物(表1)，以天山雪莲的持家基因GAPDH作为内参，引物序列参照郭新勇等[9]的研究。分别提取经过不同处理的雪莲组培苗RNA并反转录成cDNA备用。按照SYBR GreenⅠMaster Mix说明书进行qRT-PCR，采用相对定量2-ΔΔCt法计算sikFBA4在不同低温胁迫下的表达。

1.2.2sikFBA4基因启动子的克隆 以天山雪莲组培苗为材料，按照新型植物基因组DNA提取试剂盒操作步骤提取天山雪莲的基因组总DNA。

根据本实验室已克隆到的雪莲sikFBA4的基因序列设计3条嵌套的特异性引物SP1、SP2和SP3，同时合成4条随机简并引物LAD1～LAD4和一条较短的特异性引物AC1(表1)。

表1 实验所需引物Table 1 Primers used in this experiment

以雪莲基因组DNA为模板，利用Hi-Tail PCR扩增FBA4的上游序列。第1轮PCR反应体系为：DNA模板1 μL、随机简并引物LAD1～4各0.5 μL，引物SP1 0.5 μL，ddH2O 8 μL，2×Easy Taq PCR SuperMIX 10 μL。在第2轮反应中，将第1轮PCR产物稀释50倍作为第2轮反应的模板，SP1替换为SP2，其余条件不变；在第3轮反应中，将第2轮反应产物稀释50倍作为模板，SP2替换为SP3，其余条件不变。PCR反应程序参考Liu等[8]的方法。

PCR反应结束后，利用1%的琼脂糖凝胶分别对第2轮和第3轮 Hi-Tail PCR 扩增结果进行检测，选取第3轮结果中符合大小差异的特异性条带，使用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化。再将回收产物连接pEasy-T5 载体，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆后，将鉴定为阳性的菌液送北京六合华大基因股份科技有限公司测序。

1.2.3序列分析 序列比对使用DNAMAN 6完成；启动子序列调控元件分析以植物顺式调控元件数据库PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)完成；数据处理使用SPSS软件完成。

1.2.4pCAMBIA1304-PsikFBA4-GUS植物表达载体的构建 根据测序结果设计引物PsikFBA4-F(5′-ggatccATGAAGGCGAGATGGAGAA-3′)、PsikFBA4-R(5′-actagtGTGTGTGTAAGAAGTGAGGC-3′)在PsikFBA4序列上、下游分别引入BamHⅠ和NcoⅠ酶切位点并连入pEASY-T5载体。用BamHⅠ和NcoⅠ双酶切pEASY-T5-PsikFBA4重组质粒和pCAMBIA1304载体，分别回收目的小片段和载体大片段，并用T4连接酶16 ℃连接过夜，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经菌液PCR和双酶切鉴定为阳性克隆后，冻融法转入根瘤农杆菌GV3101，获得阳性转化子将其命名为pCAMBIA1304-PsikFBA4-GUS-GV3101。

1.2.5农杆菌介导的在烟草中瞬时转化及GUS酶活力的测定 瞬时转化方法参考穆建强等[10]的研究，但有所改动。将鉴定为阳性的含有重组质粒的农杆菌划线，挑单克隆于加有相应抗生素的LB培养基中，28 ℃、200 r·min-1培养过夜；再将2 mL菌液转入到50 mL的LB液体培养基中，相同条件下培养至OD600为0.5～0.6；3000 r·min-1离心15 min收集菌体，弃上清后用重悬液(10 mmol·L-1MES、10 mmol·L-1MgCl2、0.2 mmol·L-1乙酰丁香酮)调整OD值为0.8左右，室温下静置3 h待用；取已灭菌的注射器，依靠压力将菌液注入烟草叶片的叶脉之间，在黑暗条件下保温、保湿培养24 h之后恢复正常光照培养24 h(16 h光照，8 h黑暗)。对所有注射过的烟草进行冷胁迫处理，处理时间为1、3、6、12和24 h；在不同处理时间点分别用打孔器取样，分别对样品进行GUS染色和GUS酶活力测定。

GUS染色方法参考Jefferson[11]所用的染色方法，分别将各个材料浸没于GUS染液中，37 ℃染色16～24 h，使用无水乙醇将叶片中的绿色脱去，观察染色结果并拍照保存。

GUS酶活力的测定参考Jefferson[11]建立的荧光定量分析法。样品用液氮进行研磨，并使用GUS抽提液(50 mmol·L-1磷酸钠缓冲液，10 mmol·L-1EDTA，0.1% Triton X-100，0.1% SDS，10 mmol·L-1β-巯基乙醇)进行抽提；使用Bradford[13]的方法测定蛋白浓度；取100 μL蛋白上清加入到400 μL预热的GUS提取缓冲液中，再加入500 μL的MUG底物，37 ℃温浴，分别在0、15、30、45和60 min取反应混合物200 μL加入到800 μL的反应终止液中，室温避光保存；用荧光分光光度计在激发光波长365 nm,发射光波长455 nm下，狭缝10 nm时测定不同时间点的荧光值；根据测定的荧光值和蛋白浓度计算出不同胁迫时间处理条件下GUS的酶活力值。

2 结果与分析

图1 sikFBA4不同胁迫时间下的相对表达量Fig.1 Relative expression of sikFBA4 in low-temperature *：P<0.05；**：P<0.01；T检验T test.

图2 FBA4基因Tail-PCR扩增产物电泳分析Fig.2 Analysis of Hi-Tail PCR of FBA4 M：Marker 3；2:第2轮PCR产物Product of primary PCR；3：第3轮PCR产物Product of secondary PCR；LAD1～4：PCR过程中使用的简并引物 Degenerate primers.

2.1 sikFBA4在冷胁迫下的表达情况

以天山雪莲GAPDH基因为内参，利用qRT-PCR法对天山雪莲经4 ℃处理0、1、3、6、12和24 h后叶片中sikFBA4基因的相对表达量进行分析，结果如图1所示。在经低温处理后，sikFBA4的表达量迅速上升，并在胁迫1 h时，表达量达到最大，为正常条件下的10.47倍。在此之后，sikFBA4基因的表达量虽呈现出逐渐下降的趋势，但整体上仍高于正常水平，在处理3、6和12 h后，其相对表达量分别为正常水平的6.13、4.01和6.36倍。在对雪莲处理24 h之后，sikFBA4基因的表达量与正常条件下的表达量基本持平。

2.2 Hi-Tail PCR扩增产物电泳

经过3轮PCR扩增，LAD1～LAD4均有符合目标差异大小的特异性条带(图2)，选取大小合适，具有测序意义的条带进行回收并连接pEASY-T5载体进行测序。测序结果表明，扩增后所得FBA4的侧翼序列全长1828 bp。将测序所得序列与FBA基因序列进行比对发现，PCR所得序列3′端与FBA4基因5′端分别有60个碱基的重叠，且所得序列5′端与AC1完全重叠，说明扩增所得DNA片段为雪莲sikFBA4基因5′端侧翼序列。并将其命名为PsikFBA4。

2.3 天山雪莲FBA4基因启动子区域的生物信息学分析

序列经启动子分析软件PlantCARE分析表明：在PsikFBA4中，除含有多个真核生物启动子必需CAAT-Box和TATA-Box元件之外，还存在许多与光照、激素以及逆境胁迫相关的调控元件(图3)，如：冷胁迫响应元件(low temperature responsive element,LTRE)、赤霉素响应元件(GA-responsive element,TATC-box)、乙烯应答元件(ethylene-responsive element,ERE)、光响应元件(cis-acting regulatory element involved in light responsiveness,G-box)、茉莉酸甲酯响应元件(cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsivenes,TGACG-motif)、热激响应元件(cis-acting element involved in heat stress responsiveness,HSE)等(表2)。

图3 PsikFBA4主要作用元件分布Fig.3 The cis-elements distribution of PsikFBA4

调控元件Regulatory sequence序列Sequence生物学功能Biological function5UTR Py-rich stretchTTTCTTCTCT高转录水平的顺式作用元件Cis-acting element conferring high transcription levelsACECTAACGTATT光响应中的顺式作用元件Cis-acting element involved in light responsivenessARETGGTTT厌氧诱导必需的顺式作用调控元件Cis-acting regulatory element essential for the anaerobic inductionBox 4ATTAAT参与光响应的保守DNA模块的一部分Part of a conserved DNA module involved in light responsivenessBox ITTTCAAA光响应元件Light responsive elementCAAT-boxCCAAT启动子和增强子区的共同顺式作用元件Common cis-acting element in promoter and enhancer regionsCCAAT-boxCAACGGMYBHv1 结合位点MYBHv1 binding siteCGTCA-motifCGTCA茉莉酸甲酯顺式调控元件Cis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsivenessEIRETTCGACC激发响应元件Elicitor-responsive elementEREATTTCAAA乙烯应答元件Ethylene-responsive elementG-boxGACATGTGGT参与光响应的顺式作用元件Cis-acting regulatory element involved in light responsivenessHSEAAAAAATTTC热应激反应中的顺式作用元件Cis-acting element involved in heat stress responsivenessI-boxATGATATGA光响应元件的一部分Part of a light responsive elementMBSCAACTG参与干旱诱导的MYB结合位点MYB binding site involved in drought-inducibilityO2-siteGATGACATGA玉米醇溶蛋白代谢调控中的顺式作用调控元件Cis-acting regulatory element involved in zein metabo-lism regulationSkn-1_motifGTCAT胚乳表达所需的顺式作用调控元件Cis-acting regulatory element required for endosperm expressionSp1GGGCGG光响应元件Light responsive elementTATA-boxTAAAAATAA-30区的核心启动元件Core promoter element around -30 of transcription startTC-rich repeatsATTTTCTTCA防御和应激反应中的顺式作用元件Cis-acting element involved in defense and stress responsivenessTCT-motifTCTTAC光响应元件的一部分Part of a light responsive elementA-boxCCGTCC顺式调控元件Cis-acting regulatory elementCCGTCC-boxCCGTCC与分生组织特异性激活相关的顺式作用调控元件Cis-acting regulatory element related to meristem ncocific activationLTRECCGAAA参与低温反应的顺式作用元件Cis-acting element involved in low-temperature responsivenessTCA-elementCCATCTTTT参与水杨酸反应的顺式作用元件Cis-acting element involved in salicylic acid responsiveness

2.4 pCAMBIA1304-PsikFBA4-GUS植物表达载体的构建

用BamHⅠ和NcoⅠ双酶切pEASY-T5-PsikFBA4重组质粒和pCAMBIA1304载体，分别回收目的小片段和载体大片段，并用T4连接酶连接过夜，将重组质粒转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经双酶切鉴定成功后，转化农杆菌GV3101，并经菌液PCR鉴定成功。

图4 pCAMBIA1304-PsikFBA4-GUS植物表达载体的构建示意图Fig.4 Construction of plant expression vector pCAMBIA1304-PsikFBA4-GUS NOS-ter： NOS终止子NOS terminator； HygR： 潮霉素抗性基因Hygromycin； CaMV 35S： 35S启动子35S promoter； PsikFBA4： PsikFBA4启动子PsikFBA4 promoter； GFP： 绿色荧光蛋白Green fluorescent protein； GUS： β-葡萄糖苷酸酶基因β-glucuronidase gene.

2.5 农杆菌介导的在烟草中的瞬时表达及不同胁迫时间下酶活力的测定

以GV3101空菌株作为阴性对照，转入pCAMBIA1304-35S-GUS质粒的菌株作为阳性对照。利用根瘤农杆菌介导法注射烟草叶片来分析PsikFBA4在低温胁迫条件下对报告基因的诱导特性。结果表明，在阴性对照中未检测到GUS基因的表达；在阳性对照组中明显检测到GUS基因的表达；在未胁迫的转PsikFBA4-1304实验组中检测到少量的GUS基因的表达；在经过低温胁迫处理后在转入PsikFBA4-1304的实验组中能够明显检测到GUS基因的表达，且表达量随着胁迫时间的延长有上升趋势，GUS染色结果如图5所示。

图5 胁迫处理下GUS染色分析及酶活力的测定Fig.5 GUS activity of transient expression in tobacco during cold stress A:PsikFBA4-GUS-1304实验组Experimental group;B:P35S-GUS-1304阳性对照Positive control;C:阴性对照 Native control;*:P<0.05;**:P<0.01； T检验T test； 4-MU： 4-甲基伞形酮4-methylumbelliferone.

GUS活性定量分析结果表明，对植株进行冷胁迫后，PsikFBA4调控下的GUS活性随胁迫时间呈现出先增长后降低的特征。未胁迫的条件下，烟草叶片中的GUS酶活性为1.343 nmol 4-MU·min-1·mg-1；在胁迫1 h后GUS酶活力迅速上升，达到5.824 nmol 4-MU·min-1·mg-1，上升幅度约为4.33倍，在胁迫6 h时酶活力达到最大值，为10.598 nmol 4-MU·min-1·mg-1。在此之后，植株中的GUS酶活力开始出现持续的小幅度下降，并在处理24 h后达到6.874 nmol 4-MU·min-1·mg-1。与PsikFBA4相比，35S启动子驱动下的GUS酶活性在整个胁迫过程中都表现出很高的活性，除在24 h时酶活力有所下降外，其余时间点酶活力基本相同，均维持在10.5～11.5 nmol 4-MU·min-1·mg-1(图5)。

3 讨论

温度是植物正常生长的必要条件。低温胁迫几乎影响植物生命活动的全过程，尤其是光合作用受低温影响最为显著[12-13]。因此，培育具有抗寒特性的新品种具有十分重要的现实意义。果糖-1,6-二磷酸醛缩酶在生物体内可逆催化果糖-1,6-二磷酸(1,6 fructose diphosphate，FDP)的生物合成，是Calvin循环和糖质新生代谢过程中必不可少的一个关键调控酶[14]。Uematsu等[15]的研究表明，在烟草中超表达来自拟南芥(Arabidopsisthaliana)质体的FBA基因，可提高转基因烟草的光合速率，并促进转基因烟草的生长和生物量的积累。而本实验室在前期的工作中通过对转sikFBA4基因的番茄(Lycopersiconesculentum)进行低温光适应性研究发现，sikFBA4对提高番茄的抗寒性也具有显著的作用。

实时荧光PCR结果表明，sikFBA4对冷胁迫的响应十分敏感，表达量的变化十分剧烈，在胁迫处理1 h后其表达量达到对照组的10倍左右，在此之后表达量随着时间逐渐降低。产生这一现象的原因可能是天山雪莲在感知冷信号之后产生应激反应，通过表达量的升高来满足植物机体对冷胁迫的响应，而在其对低温环境适应后，表达量逐渐下降以减少能量的损耗。sikFBA4对低温环境十分敏感的特性，表明sikFBA4在天山雪莲应对低温胁迫的过程中扮演了重要的角色，而本研究的启动子序列分析结果也显示在PsikFBA4中确实存在着与冷胁迫等逆境相关的顺式作用元件。

sikFBA4基因启动子的克隆和分析表明，sikFBA4基因启动子全长为1828 bp，包含有30个CAAT-Box和83个TATA-Box，除此之外还包含有多个与逆境胁迫相关的顺式作用元件，如ABRE元件、ARE元件、MBS和LTRE等元件。其中，LTRE是与低温诱导相关的转录因子CBFs的结合位点[16-17]，CBFs可通过与启动子上的顺式作用元件结合而启动相关基因的表达。Jaglo等[18]通过在甘蓝(Brassicaoleracea)和油菜(Brassicanapus)中表达来自拟南芥CBF1基因，使其抗寒性较野生型有明显的提高；甄伟等[19]通过在烟草中转入来自油菜的CBF1基因得到了抗寒性明显提高的烟草植株。因此，植物可通过CBFs来调控下游大量抗寒相关基因的表达来提高植物的抗寒能力。ABRE是脱落酸(ABA)信号通路中的关键顺式作用元件。植物在受到低温胁迫时，体内的ABA含量增加[20]，而ABA含量的增加可通过ABA信号通路活化其下游的bZIP转录因子ABFs，ABFs可通过与ABRE的结合调控下游基因的表达[21-25]。因此推测，ABRE顺式作用元件的存在可能也是sikFBA4能够响应低温胁迫的重要原因之一。

为了进一步验证PsikFBA4启动子在低温下的诱导特性，本研究构建了以GUS为报告基因植物表达载体并在烟草中进行瞬时表达，瞬时表达后的GUS染色结果表明，经低温胁迫后发现，在PsikFBA4的驱动下GUS基因的表达量在未胁迫的情况下仅有少量的表达，而在经过低温胁迫后GUS基因的表达量有了显著的升高。之后的GUS酶活力测定结果与瞬时表达后的染色结果基本一致，表明PsikFBA4具有在低温条件下诱导报告基因表达的能力，并进一步证明了PsikFBA4是一种低温诱导型启动子。

干旱、高盐、低温等非生物胁迫因素能够诱导植物体内相关基因的表达，这一调控过程的主要机制就是逆境胁迫相关的转录因子与基因上游的启动子关键顺式作用元件结合，增强启动子的活性从而提高相关目的基因的表达量。在当前的转基因工程中，广泛使用的是组成型启动子，但由于组成型启动子能够驱动目的基因在植物的各个组织中恒定而持续的表达，而不能从空间和时间上有效的调控目的基因的表达，从而过度的消耗植物中的物质和能量造成不必要的浪费，并最终影响到植株的正常生长发育。孟慧等[26]在拟南芥中过量表达玉米ABP9基因后发现，与野生型相比，ABP9过量表达的植株在种子萌发，幼苗的生长以及开花阶段的生长均受到抑制，同时叶片内源ABA含量降低，ABA信号传导基因表达增强而ABA合成基因表达降低，表型受到严重的影响。而诱导型启动子的利用，则可能实现对外源基因的时、空、量的三维表达调控，在提高植物抗逆特性的基础上保证植物的正常发育。因此具有经济、环保及生物安全等多方面的潜在价值。因此，相对于组成型启动子而言，诱导型启动子具有更高的实际研究价值。在本实验中，以具有良好抗寒特性的天山雪莲为材料，分离出果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因FBA4的上游启动子序列，并通过实时定量PCR和在烟草中的瞬时表达确定其为低温诱导的启动子，为进一步研究天山雪莲的抗寒机制奠定了基础。

4 结论

本实验通过实时荧光定量PCR技术分析了天山雪莲果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因sikFBA4在低温胁迫下的表达模式，并分离出sikFBA4基因的上游启动子序列进行生物信息学分析。结果发现，在低温胁迫的条件下，sikFBA4基因的表达量显著升高，在其上游启动子序列中存在低温应答元件LTRE。接下来构建了PsikFBA4与GUS基因的融合表达载体并在烟草中进行瞬时表达，GUS染色和酶活力测定的结果显示在经过低温处理之后GUS基因的活性显著增强，表明PsikFBA4能够在低温胁迫诱导的条件下驱动下游基因的表达，为冷诱导型启动子。为对天山雪莲sikFBAs基因的表达调控机制进行进一步的研究，接下来要对PsikFBA4启动子进行系列缺失分析，通过构建不同长度的缺失表达载体导入烟草进行功能验证从而确定其核心启动子区域。同时构建植物表达载体PsikFBA4-sikFBA4和P35S-sikFBA4导入烟草，比较不同类型启动子驱动下外源基因的导入对植物生理指标的影响，以期对抗寒植物的培育做出贡献。