红壤旱地玉米开花期土壤酶活性对长期施肥的响应

柳开楼，韩天富，胡惠文，黄庆海*，余喜初，李大明，叶会财，胡志华

（1 江西省红壤研究所/国家红壤改良工程技术研究中心/农业部江西耕地保育科学观测实验站，江西南昌 330046；2 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所，北京 100081）

在我国南方丘陵区中，红壤是重要的耕地资源。自1980年以来，由于世界银行贷款资助的“红壤开发”项目和我国农业部门的耕地整治项目等的大力实施，使该地区红壤旱地资源得到了明显改善，为当地的粮食生产和农业增收做出了巨大贡献[1–2]。但是，由于红壤成土过程中的脱硅富铝和人为不合理的施肥措施，导致较多的红壤旱地存在水土流失、土壤酸化加剧和肥力下降的现象[3–7]，从而严重限制了红壤旱地生产力的提高。

土壤培肥是保障作物丰产的基础，更是实现“藏粮于地”的重要途径。在土壤培肥过程中，土壤酶活性作为表征土壤肥力的关键生物学指标[8–10]，其对施肥等农艺措施的响应十分敏感[11–13]。目前，土壤中已被鉴定出约60种酶活性，但大多数的研究中主要涉及氧化还原酶、水解酶、转移酶、裂合酶等4大类[9]。大量研究表明，施肥措施可以通过影响土壤氮磷钾养分含量、微生物活性和作物根系生长等改变土壤酶活性[14–15]。在前人的研究中，两两相关[16–17]、主成分分析[18–19]等方法均表明，土壤酶活性与土壤有机碳和氮磷养分存在显著相关；也有研究通过线性拟合方程发现，土壤有机碳和微生物量碳是影响1，5-二磷酸核酮糖核苷酸 (Rubisco) 酶的关键因子[20]。在这些众多的土壤酶活性指标中，由于土壤酶的催化作用参与了土壤有机碳、氮磷钾的循化和迁移[21]，因此，土壤酶活性与很多土壤理化指标存在密切相关。因而进一步开展土壤关键酶活性因子的筛选研究就显得十分迫切。近年来，随着R语言的广泛应用和冗余分析 (RDA) 等生态学统计方法的推广，为土壤酶活性与其他土壤理化生指标的相互关系研究奠定了基础。且已经有研究运用RDA分析表明，在盆栽试验条件下，水稻根际土壤中碳氮过程关键酶 (α-葡萄糖苷酶和乙酰氨基葡萄糖苷酶) 活性的主要影响因子为土壤微生物生物量碳和可溶性有机碳含量[14]。而在滨海滩涂围垦区，解雪峰等[22]的研究表明，土壤理化性质对土壤酶活性影响的顺序表现为全氮 ＞ 有机碳 ＞ 全磷 ＞ 电导率。但是，在长期施肥的红壤旱地上，鲜有研究基于RDA等方法深入探讨土壤酶活性与其他土壤性质的相互关系。同时，除了土壤有机碳和氮、磷等理化指标，作物的生长可以通过根系分泌物或吸收养分等途径进一步影响土壤酶活性[14,23]。但是，作为表征土壤肥力的综合指标，作物的氮磷钾养分与土壤酶活性的相关关系还鲜有报道。

目前已经有研究表明，作物生长旺盛时期的土壤酶活性可以较为准确地反映施肥等措施的影响[14–15]。然而，一方面，这些研究均集中在探讨调控土壤酶活性的关键土壤理化指标方面[14,22]，而忽略了作物生长与土壤酶活性的相互影响；另一方面，鲜有研究对长期施肥措施下关键的土壤酶活性因子进行筛选和提炼，尤其是在红壤旱地上[14,24–27]。因此，本研究基于始于1986年的红壤旱地长期施肥定位试验，以玉米开花期为切入点，研究不同施肥处理的土壤酶活性变化规律，并结合土壤速效养分和玉米氮、磷、钾含量等指标，利用RDA方法探讨驱动红壤旱地土壤养分和作物生长变化的关键土壤酶活性因子，从而为深入分析土壤酶活性对长期施肥的响应机制提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验地概况

试验地位于江西省进贤县江西省红壤研究所内(116°17'60''E、28°35'24''N)，年均气温 18.1℃，≥10℃积温6480℃，年降雨量1537 mm，年蒸发量1150 mm，无霜期约为289 d，年日照时数1950 h。试验土壤为红壤旱地，成土母质为第四纪红粘土。试验从1986年春季开始，试验前耕层 (0—20 cm) 土壤pH 6.0，有机碳含量为9.39 g/kg，全氮、全磷和全钾含量分别为0.98 g/kg、0.62 g/kg和11.36 g/kg，碱解氮、有效磷和速效钾含量分别为60.3 mg/kg、5.6 mg/kg和70.25 mg/kg。

1.2 试验设计

本研究共选取5个施肥处理：不施肥 (CK)；氮磷钾化肥 (NPK)；2倍氮磷钾化肥 (2NPK)；氮磷钾化肥配施有机肥 (NPKM)；单施有机肥 (OM)，具体施肥量见表1。每个处理3次重复，小区面积22.2 m2，随机排列。氮磷钾肥分别为尿素、钙镁磷肥、氯化钾，有机肥为鲜猪粪 (鲜重15000 kg/hm2，含水量为75%，N、P、K含量分别为6.0 g/kg、4.5 g/kg、5.0 g/kg)。其中，磷肥、钾肥和有机肥在播种前做基肥施用，氮肥分两次施，50%做基肥，50%在拔节期做追肥。种植制度为早玉米–晚玉米，其他管理措施与农民习惯相同。

1.3 样品采集和分析

1) 玉米样品采集和氮磷钾含量测定 于2017年早玉米开花期 (6月18日)，每个小区采集3穴植株样，带回室内，105℃杀青，85℃烘干至恒重，研磨过筛。样品经H2SO4–H2O2消煮后，全氮用微量凯氏定氮法测定，全磷用钼锑抗比色法测定，全钾用火焰光度法测定[28]，并根据干物质和氮磷钾含量进一步计算各处理玉米植株的氮磷钾吸收量。

2) 土壤样品采集和酶活性及pH、有机碳、速效氮磷钾含量测定 于2017年早玉米开花期 (6月18日)，每个小区按5点取样法采集耕层土壤混合样品，带回室内，挑出根系、石块等杂质，按四分法分出一半鲜样测定土壤酶活性，剩余一半样品摊匀风干，磨细过筛分析土壤pH、有机碳和速效氮磷钾含量。

选取了与土壤碳氮磷周转密切相关的7种土壤酶活性，其中土壤蔗糖酶 (INV) 采用3，5-二硝基水杨酸比色法；脱氢酶 (DEH) 采用氯化三苯基四氮唑还原法测定；纤维素酶 (CEL) 采用3，5-二硝基水杨酸比色法；脲酶 (UR) 采用靛酚蓝比色法测定；多酚氧化酶 (PHOX) 采用邻苯三酚显色法；酸性磷酸酶(ACP) 采用磷酸苯二钠比色法测定；β-葡糖苷酶(BG) 采用对硝基酚比色法。具体方法参考关松荫的方法[29]。土壤pH采用pH计测定；有机碳采用K2Cr2O7−H2SO4氧化法；无机氮采用2 mol/L KCl浸提—流动分析仪测定；有效磷采用HCl-NH4F法；速效钾采用NH4OAc浸提—火焰光度计法。以上具体分析方法按《土壤农化分析》[28]进行。

采用Excel 2003进行数据处理，统计分析采用SAS 9.1进行，各处理的土壤酶活性、速效氮磷钾和玉米氮磷钾含量及吸收量差异采用LSD法进行显著性分析 (P ＜ 0.05)，土壤酶活性与土壤速效氮磷钾和玉米氮磷钾含量及吸收量的相互关系采用RDA方法(R软件包vegan) 进行分析，SigmaPlot 12.0作图。其余图件均采用Origin 8.1进行制作。

表1 不同处理化肥和有机肥施用量 (kg/hm2)Table 1 The amounts of chemical and organic fertilizers in different treatments

2 结果与分析

2.1 长期施肥对玉米开花期土壤酶活性的影响

在玉米开花期，不同处理下土壤酶活性基本呈现出NPKM处理最高，其次为OM和2NPK处理，而NPK和CK处理最低的规律 (图1)。除了CEL之外，NPKM处理均显著高于OM和2NPK处理，其INV、DEH、UR、PHOX、ACP和BG分别比OM处理增加了13.7%、13.5%、10.6%、10.5%、5.6%和13.4%，比2NPK处理增加了32.4%、112.2%、22.8%、33.3%、27.6%和50.4%。同时，除了CEL之外，OM处理的其他酶活性指标均显著高于2NPK处理。而在NPK和2NPK之间，则呈现出2NPK处理的CEL和UR显著高于NPK处理 (增幅分别为26.0%和50.6%)，但INV、DEH、PHOX、ACP和BG均无显著差异。与CK处理相比，除INV、DEH、CEL2之外，NPK处理的UR、PHOX、ACP和BG均显著增加，增幅分别为17.1%、35.7%、25.8%和123.85%。

2.2 长期施肥对玉米开花期土壤pH和有机碳含量的影响

图2表明，NPKM和OM处理的土壤pH和有机质含量显著高于其他处理。与NPK处理相比，NPKM和OM处理的土壤pH分别增加了0.91和1.35个单位，土壤有机碳含量分别增加了30.8%和26.2%。但是，玉米开花期土壤pH和有机碳含量对不同化肥施用的响应略有不同。土壤pH主要表现出NPK和2NPK处理显著低于CK处理 (降幅分别为0.39和0.67个单位)；而对于土壤有机碳，2NPK处理比CK处理增加了16.2%，而NPK处理则与CK处理相比无显著增加。

2.3 长期施肥对玉米开花期土壤速效养分含量的影响

图1 长期施肥玉米开花期土壤酶活性Fig. 1 Soil enzyme activities in flowering stage of maize after 31 years fertilization

图2 长期施肥玉米开花期土壤pH和有机碳变化Fig. 2 The change of soil pH and organic carbon in flowering stage of maize after 31 years fertilization treatments

表2 长期施肥下玉米开花期土壤速效养分含量 (mg/kg)Table 2 Soil available nutrient contents in flowering stage of maize after 31 years fertilization

长期不同施肥处理下土壤无机氮、有效磷和速效钾含量在玉米开花期内的变化趋势基本相似 (表2)，各处理均呈现出施肥处理显著高于不施肥处理，且施肥处理中以NPKM处理显著较高，其次为2NPK和OM处理，而NPK处理较低。与NPK处理相比，NPKM处理的无机氮、有效磷和速效钾含量分别增加了85.2%、609.0%和95.3%，2NPK处理分别增加了34.0%、45.8%和84.8%，OM处理分别增加了77.3%、508.4%和61.6%。同时，在NPKM和OM之间，除了土壤无机氮不存在显著差异外，NPKM处理的有效磷和速效钾均显著高于OM处理 (增幅分别为16.5%和20.8%)。但是，在NPKM和2NPK之间，则表现出NPKM的无机氮和有效磷显著高于2NPK处理 (增幅分别为38.3%和386.4%)，而速效钾则无显著差异。

2.4 长期施肥对玉米开花期植株氮磷钾含量和吸收量的影响

与土壤速效养分的规律一致，玉米开花期的植株氮磷钾含量也呈现出施肥处理显著高于不施肥处理的趋势，且在施肥处理中以NPKM处理最高(表3)。与NPK处理相比，NPKM处理的玉米氮磷钾含量分别增加了15.2%、72.2%和32.4%，但OM处理则与NPK处理不存在显著差异，2NPK处理除了磷含量显著高于NPK处理之外，氮和钾含量则无显著差异。本研究进一步计算了植物氮磷钾吸收量，其结果与植株氮磷钾含量的结果相似，各处理的植株氮磷钾吸收量也呈现出施肥处理显著高于不施肥处理的趋势，且施肥处理中以NPKM处理最高 (表3)。与NPK处理相比，NPKM处理的氮磷钾吸收量分别增加了15.1%、71.1%和32.2%；但2NPK和OM处理的植株氮钾吸收量与NPK处理相比均不存在显著差异；磷吸收量则呈现出2NPK处理显著高于NPK处理，而OM处理则与NPK处理不存在显著差异。

2.5 驱动土壤速效养分和玉米氮磷钾含量的关键土壤酶活性因子分析

冗余分析 (RDA) 表明，在玉米开花期，轴1和轴2分别解释了土壤酶活性变异程度的99.68%和0.23% (图3)。不同施肥措施的影响差异明显，其中NPKM和OM处理占据了第1象限，2NPK和NPK处理占据第2象限，CK处理占据第3象限，且NPKM和OM处理与所有指标均呈正相关性。同时，所有酶活性指标均可以显著影响土壤pH、有机碳、速效氮磷钾和玉米氮磷钾含量及吸收量 (P ＜ 0.01)，其中INV、CEL和UR是最关键的酶活性指标 (R2＞ 0.90，P ＜ 0.001) (表 4)。

表3 长期施肥下玉米开花期植株养分含量及吸收量Table 3 Plant nutrient contents and uptake in flowering stage of maize after 31 years fertilization

图3 开花期土壤酶活性与土壤及植株养分之间的RDA分析Fig. 3 RDA analysis of relationship between soil enzyme activities and soil and plant nutrient in flowering stage of maize

3 讨论

3.1 长期施肥下玉米开花期土壤酶活性变化

在红壤旱地，玉米开花期各种土壤酶活性对长期不同施肥的响应基本一致，均呈现出有机无机肥配施比化肥施用更有利于提高土壤酶活性的趋势，这与前人的研究结果相似[11–13]，原因主要是化肥长期施用导致土壤微生物活性降低，而有机无机肥则可以显著增加土壤微生物活性[30–31]。微生物活性的高低可以显著影响土壤酶活性[32–33]。且有研究表明土壤酶活性与有机肥投入量成显著的线性正相关关系[33]，但不同有机肥种类则对土壤酶活性的提升效果不一[34]。然而，本研究的结果显示，土壤酶活性强度与长期施肥下红壤旱地的其他研究结果存在较大差异，且本研究中有机无机肥处理的土壤酶活性比单施有机肥增加了5.6%～13.7%，比2倍氮磷钾肥处理增加了12.0%～112.2%，尤其是脱氢酶活性，有机无机肥配施处理比2倍氮磷钾肥用量增加了112.2%。原因可能与采样时期和种植作物类型有关，张继光等[11]在春季3月份采样，邵兴华等[12]则是在玉米苗期采样，郑勇等[13]的结果是来源于长期种植花生的红壤旱地，而本研究则是在玉米开花期采样，同时，也有研究表明，与非根际土壤相比，根际土壤的酶活性指标更能准确反映长期施肥下的土壤酶活性[14,23]。因此，在土壤酶活性的后续研究中，建议进一步统一采样时期，并利用根际土壤样品，从而有利于综合比较不同研究结果的差异。

表4 开花期土壤酶活性与土壤及植株养分含量的显著性分析Table 4 Correlation significance of soil enzyme activities with the soil and plant nutrient contents in flowing stage of maize

同时，与化肥处理 (2NPK和NPK) 相比，单独施用有机肥处理也可以显著增加除纤维素酶之外的所有酶活性指标。这一方面是由于化肥处理显著降低了土壤pH，且其土壤有机碳含量也显著低于有机肥处理，而pH和有机碳含量是调控土壤酶活性的重要因素[8–10]。另一方面，长期施用有机肥还可以有效改善土壤结构，增强红壤旱地抵抗干旱等环境胁迫的能力[35–36]，而适宜的土壤环境则是土壤酶活性增强的因素之一[10]。但是，在不同化肥用量处理之间，则呈现出了2倍氮磷钾肥处理的CEL和UR活性显著高于氮磷钾肥处理，而其他酶活性指标则无显著差异。这主要与不同施肥处理导致玉米生长差异有关，而较大的生长差异可以直接通过根系分泌物影响土壤酶活性变化[10,37]。然而，由于本试验中的肥料用量一直为20世纪80年代的施肥水平，其2倍的氮磷钾化肥用量基本等同于现在的施肥水平，因此，增加化肥用量提高土壤酶活性的结果还有待进一步验证。

3.2 驱动土壤速效养分和植株养分吸收的关键土壤酶活性因子

土壤酶活性作为较为敏感的土壤生物学指标，其在土壤肥力因子变化中起着十分重要的作用[8–10]。同时，土壤酶活性也可以通过根系分泌物影响氮磷钾养分向地上部运转[10,37]。因此，研究土壤酶活性因子与土壤养分及地上部作物的相互关系就显得尤为重要。在本研究中，与土壤酶活性的规律相似，土壤速效养分和植物氮磷钾含量也呈现出有机无机肥处理显著高于其他施肥处理的趋势，这与前人的研究结果相似[7,12]，也进一步表明土壤地下和地上部的养分状况对长期施肥的响应与土壤酶活性基本相同。其原因主要与这些土壤酶参与了土壤氮磷钾的养分周转有关[21]。

本研究利用RDA分析方法发现，在玉米开花期，不同施肥措施的影响差异明显，其中有机无机肥配施和单施有机肥处理与所有指标均呈正相关性，这充分说明有机肥对土壤肥力的提升效果。同时，所有酶活性指标均与土壤速效氮磷钾和植株养分吸收呈显著的正相关关系，这与大量的研究结果一致[15–17]。但是，在不同酶活性指标中，发现蔗糖转化酶、纤维素酶和脲酶是表征土壤速效养分和作物养分吸收的关键酶活性因子，这为该地区开展土壤酶活性指标筛选提供了理论依据。这与其他人在红壤旱地上的结果略有不同[24–25]，原因可能与种植作物类型、肥料用量、施肥年限和土壤样品采集时间等有关[24–26]。同时，与其他土壤类型相比也存在明显差异，例如在西北塿土上，土壤脲酶、转化酶和碱性磷酸酶是表征土壤肥力水平的关键因子[27]。在太湖稻麦种植区的高产水稻土上，磷酸酶、芳基硫酸酯酶和β-葡萄糖苷酶活性是土壤肥力的综合评价指标[18]。而在双季稻种植区的低产水稻土上，β-葡萄糖苷酶、β-木糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-纤维二糖苷酶活性可以用于表征低产黄泥田的肥力变化[34]。这可能与不同土壤类型的有机碳和氮磷钾养分差异较大有关。因此，在后续研究中，不同土壤类型的关键酶活性指标还有待进一步深入研究。

4 结论

在红壤旱地上，玉米开花期土壤酶活性均呈现出有机无机肥配施显著高于化肥施用和单独的有机肥施用处理，而化肥用量则会显著改变土壤纤维素酶和脲酶活性。同时，土壤有机碳、速效氮磷钾和玉米氮磷钾含量对长期施肥的响应规律与土壤酶活性大体相似。进一步分析表明，蔗糖转化酶、纤维素酶和脲酶是驱动土壤养分周转和迁移的关键酶活性因子。