正交设计优化东北茶藨子的活性成分提取工艺

金志民，柴军红，何婷婷，景云荣

(牡丹江师范学院，黑龙江牡丹江157011)

东北茶藨子(Ribesmandshuricum),又名灯笼果、虎耳草科，茶藨属灌木[1-2]。青果多汁味酸，富含维生素C[3]、山柰酚及衍生物、多糖、有机酸[4]等多种药理活性成分，其中黄酮成分对炎症因子抑制效果好，富含维生素C、多酚、多糖物质，所以有一定抗氧化、抗疲劳作用[5-6]，也具有潜在抗肿瘤活性[7]。此外还具有一定的降血糖、降血脂、提高耐力、抗病毒等[7-8]，因此有必要进一步研究其提取工艺。现阶段研究主要集中叶片总酚、总黄酮工艺研究[9]，功能饮料研制[10]，对于果实研究较少，所以有一定的应用价值。

本文以牡丹江产东北茶藨子(Ribesmandshuricum)为原料，以总黄酮及多糖为指标，借助正交试验法优化工艺，希望为东北茶藨子开发利用、活性成分提取纯化提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

葡萄糖、浓硫酸(AR，上海国药集团)，无水乙醇、甲醇(AR,天津市致远化学试剂有限公司)，芦丁对照品>99%(贵州迪大生物技术公司)，苯酚(AR，沈阳试剂五厂)，硝酸铝(上海埃彼化学试剂有限公司)，纤维素酶R-10和果胶酶(WOLSEN,日本)等。

1.2 主要仪器

JHH-4四孔数显恒温水浴锅(金坛市精达仪器制造有限公司)，JJ-2型组织捣碎机匀浆机(武汉世纪超杰实验仪器有限公司)，T6紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，BS214D电子天平(德国赛多利斯集团)，RE-52AA旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，SL-2010N超声波萃取装置(南京顺流设备有限公司)等。

1.3 活性成分测定方法

1.3.1 总黄酮测定方法

标准曲线：依据文献[9]配制1mg/mL母液，再分别精确配制0.1～0.7mg/mL，待测溶液，在505nm波长下，采用亚硝酸钠-硝酸铝法[11]，制作标准曲线。

样品测定：提取液回收溶剂，浓缩并真空干燥，取适量，用少量甲醇超声溶解，取80%甲醇定容至100mL容量瓶中，移取上清1mL母液于25mL比色管依据以上方法测定含量。

1.3.2 多糖测定方法

标准曲线：依据文献[11]配制0.1mg/mL母液。取0.5、1、1.5、2、2.5、3mL于25mL比色管中，配制待测溶液。在490nm波长下，依据硫酸-苯酚显色法[11-12]，制作标准曲线。

样品测定：将提取液回收溶解，浓缩原体积1/8～1/10，加无水乙醇至80%以上，静置8～12h，3000转/min离心15～20min，热水溶解，以纯水为溶剂定容至100mL容量瓶中，移取1mL母液于25mL比色管依据上法测定含量。

1.4 正交试验优化提取工艺

表1 正交试验因素与水平

选择酶添加量、超声提取时间、pH值为试验因子，以总黄酮、多糖得率为指标，设计L9(34)正交试验，各因素水平见表3。

2 结果与讨论

2.1 活性成分标准曲线

2.1.1 黄酮标准曲线

依据1.3.1方法建立标准曲线，芦丁对照品在(0.11～0.56)mg/mL，线性关系良好。其回归方程为Y=0.592x+0.0125,R2=0.9999。

2.1.2 多糖标准曲线

依据1.3.2.方法建立标准曲线，多糖对照品在(2.33～23.3)μg/mL范围内呈良好线性关系。其回归方程为Y=0.0174x+0.0227，R2=0.9997。

2.2 正交工艺优化

通过实验比较选取超声时间，酶添加量，超声功率pH为主要因素进行正交设计，选取L9(43)，每组实验平行3次取平均值，其结果如表2。

表2 正交分析结果

为了更好地评价工艺，将以上多糖及总黄酮收率加权，综合考核工艺。加权方法如下：二者算数平均值比值为系数[11]，经计算为2.13，将多糖转换成总黄酮，即多糖收率乘以2.13加上总黄酮收率总为总指标。公式如下：

总指标=2.13×T(多糖)+F(黄酮)

通过R值其所选因素影响是：时间>酶浓度>功率>pH，最佳工艺条件4号A2B1C2D3，提取时间40min，酶浓度0.5%，pH=5，功率在450W，其加权收率为18.6864。依据K值可能最佳组合A1B3C3D4不在正交设计表范围内，所以需要进一步验证，以期获得最佳工艺。将A1B3C3D4组合依据前方法提取，获得收率多糖为6.65%，总黄酮为2.89%，其结果低于组合A2B1C2D3，所以最佳工艺为A2B1C2D3。

2.3 放大实验

依据2.3，选取4号作为工艺考参数实验扩大10倍，每组重复3次，结果取算数平均值，验证工艺稳定性。其结果如下表3。

表3 工艺稳定性实验

通过稳定性实验放大10倍后，其黄酮提取率平均值为3.1716%，标准偏差0.09%，多糖为7.3933%，标准偏差0.21%，表明提取工艺参数较为稳定。

3 结论

对东北茶藨子活性成分提取进行了研究，正交实验优化和加权分析显示，超声波-酶促提取法有利于茶藨子总黄酮及多糖的提取，并具有提取时间短、耗能相对较低的特点。其多糖得率为7.39%，总黄酮为3.17%。

总之, 本工艺二种主要指标在放大10 倍后，工艺相对稳定，标准偏差均在1%以内。所以以上工艺具有一定应用价值。