鸡爪槭叶色变化机制研究

罗安才， 阎晓灵， 李利霞， 赵正武， 唐安军

(重庆师范大学生命科学学院，重庆 400047)

鸡爪槭(Acerpalmatum)是槭树科槭属植物，典型的彩叶树种，随着秋季光合作用产物的变化，叶片中色素种类、含量和比例会发生相应改变，从而导致叶片颜色改变[1]。但是目前关于槭树科植物叶色变化的研究主要集中在环境因素、色素含量及可溶性糖等生理指标变化方面[2-7]，没有关于某一特定品种鸡爪槭叶色变化的系统性研究，如关于细叶鸡爪槭叶片常年是绿色而紫红叶鸡爪槭叶片常年是红色的原因是什么，还不曾有人进行探究；分子方面关于颜色变化相关基因准确定位的研究也没有报道。本研究以3种鸡爪槭为研究材料，测量鸡爪槭变色期相关生理指标，通过比对及差异性分析，探究紫红叶鸡爪槭叶片变红的机制，并用SRAP分子标记技术[8]初步探索控制鸡爪槭叶片颜色改变的基因，从而为鸡爪槭在景观配置中多彩化和合理化应用提供一定的参考，为彩叶植物新品种的引进提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 研究材料

研究材料采自重庆市南山植物园，取生长条件相同的紫红叶鸡爪槭(Acerpahnatumcv.atmpurpureum)、细叶鸡爪槭(Acerpahnatumcv.dissectum)和血红枫(Acerpahnatumcv.atropurpureum)的新鲜叶片，于2014年5—11月共7个月，每月的28日10：00定时采集，并迅速带回实验室贮存于 -80 ℃ 的超低温冰箱中。

1.2 生理指标的测定

将采集的新鲜叶片洗净擦干，去掉叶脉和叶柄，剪碎后混合均匀，作为样品以备后续试验。每组试验测量3次，测得数据用Excel作图，用SPSS 19.0进行差异显著性分析(α=0.05 或α=0.01)。

1.2.1 含水量的测定 称量样品的鲜质量(FW)，105 ℃烘箱内烘烤8 h，称其干质量(DW)。含水量(RWC)的计算公式：RWC=(FW-DW)/FW×100%。

1.2.2 叶绿素含量的测定 精准称取0.1 g样品烘干，加 10 mL 无水乙醇和80%丙酮混合液提取[9]，以80%丙酮为对照测上清液分别在645、663 nm下的吸光度(D)。计算公式：

叶绿素a含量(mg/g)=(12.71D663 nm-2.59D645 nm)×V/(1 000DW)；

叶绿素b含量(mg/g)=(22.88D645 nm-4.67D663 nm)×V/(1 000DW)；

叶绿素总含量(mg/g)=(8.04D663 nm+20.29D645 nm)×V/(1 000DW)。

1.2.3 花色素苷、类黄酮和总酚含量的测定 精准称取 0.1 g 样品烘干，加5 mL 0.1%的盐酸乙醇混合液提取[10]，以提取液作对照，分别测定530 nm、320 nm、280 nm处的吸光度。

花色素苷相对含量(mg/g)=D530 nm/DW；

类黄酮相对含量(mg/g)=D320 nm/DW；

总酚相对含量(mg/g)=D280 nm/DW。

1.2.4 可溶性糖含量的测定 精准称取0.1 g样品烘干，用蒽酮比色法[11]测量叶片中可溶性糖的含量。

1.2.5 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的测定 精准称取0.5 g样品烘干，加5 mL提取液提取粗酶液[12]，取1 mL粗酶液加 1 mL 苯丙氨酸(0.02 mol/L)和2 mL硼酸缓冲液，30 ℃恒温水浴1 h，用0.2 mL HCl(6 mol/L)终止反应，检测290 nm处的吸光度。以测定管反应液吸光度1 h增加0.01为1个酶活性单位(U)[13]。

PAL活性[U/(g·h)]=D290 nm×Vt×V/(0.01×Vs×DW×t)。

式中：Vt表示酶液总体积，mL；Vs表示测定时取酶液的量，mL；V表示反应液总体积，mL；t表示反应时间，h。

1.2.6 胆色素原(PBG)含量的测定 精准称量0.5 g样品烘干，加5 mL提取液后沸水浴10 min，冷却后加2 mL Ehrlich-Hg显色[14-16]，测553 nm处的D值。

PBG含量(μg/g)=D553 nm×47×稀释倍数。

1.2.7 5-氨基酮戊氨酸(ALA)含量的测定 精准称取 0.5 g 样品充分研磨，加5 mL提取液提取，离心后取上清液加显色剂显色[17]，测553 nm处的D值。

ALA含量(μg/g)=D553 nm×47×稀释倍数。

1.3 分子标记

1.3.1 DNA的提取 用TaKaRa公司提供的试剂盒，按试剂盒所示步骤提取鸡爪槭叶片DNA。

1.3.2 SRAP反应体系 SRAP反应体系组成详见表1。SRAP-PCR 程序：94 ℃预变性 5 min；前5个循环以94 ℃变性1 min，35 ℃复性1 min，72 ℃延伸1 min进行，接着将退火温度升至50 ℃，其他条件不变，进行35个循环；最后72 ℃再延伸5 min，于4 ℃冰箱保存备用。

表1 SRAP反应体系

1.3.3 SRAP标记引物的筛选和PCR产物的检测 SRAP引物由上海生物工程技术有限公司合成，取DNA质量较好的样品(细叶鸡爪槭)用1.2%的琼脂糖凝胶电泳进行初步的引物筛选，较好的引物组合再进行复选。再用2%的琼脂糖凝胶检测PCR扩增产物，用银染法对凝胶进行染色，再用相机记录差异条带。

1.3.4 差异条带的切割与纯化和二次PCR 切下差异条带进行称量，1 g凝胶对应1 mL Binding Buffer，然后55～60 ℃水浴至胶溶解，再按步骤纯化DNA。同样体系中以纯化后的DNA为模板进行二次PCR，用丙烯酰胺凝胶电泳验证条带大小及单一性。

1.3.5 测序和比对分析 将二次PCR后的样品送到上海英俊生物公司进行测序，测序结果用NCBI数据库进行Blast数据比对分析。

2 结果与分析

2.1 生理指标测定结果与分析

由图1-A可知，紫红叶鸡爪槭和细叶鸡爪槭的含水量均在7月达到最高值，分别为66.32%和65.78%，在11月降到最低，分别为15.26%和10.47%。2个材料变化趋势相近，不存在显著性差异。

由图1-B可知，在观察期内2种鸡爪槭的叶绿素a和b的含量随时间均呈现呈升—降变化趋势，细叶鸡爪槭和紫红叶鸡爪槭的叶绿素a含量均在7月最高，分别为10.29、3.03 mg/g；在11月含量最低，分别为0.59、0.62 mg/g。2种鸡爪槭的叶绿素a在5—8月内存在显著性差异(P<0.05)，8月份后差异不显著。细叶鸡爪槭和紫红叶鸡爪槭的叶绿素b含量在7月最高，分别为11.04、3.63 mg/g；在11月含量最低，分别为1.09、0.91 mg/g。2种鸡爪槭的叶绿素b含量仅在5、6月存在显著性差异(P<0.05)。综合得知，2种鸡爪槭叶绿素a和叶绿素b的含量都是嫩叶和老叶含量低，成熟叶片含量高。

由图1-C得知，在整个研究过程中，细叶鸡爪槭叶绿素总含量呈单峰值，紫红叶鸡爪槭则随时间呈双峰值。细叶鸡爪槭总叶绿素含量最高在10月，达到10.15 mg/g，最低在5月，只有3.83 mg/g；紫红叶鸡爪槭的总叶绿素含量最高在7月，有6.64 mg/g，这与夏季高温返青现象有关，最低在11月，仅有1.56 mg/g。在5月后，细叶鸡爪槭的叶绿素总含量总是大于紫红叶鸡爪槭，这与细叶鸡爪槭常年绿色相关。2种鸡爪槭叶绿素总含量在6、9、10这3个月存在显著性差异(P<0.05)，7、8月间差异不显著。

分析图1-D，在整个观察期，2种鸡爪槭花色素苷的相对含量变化趋势因品种不同而存在显著差异。细叶鸡爪槭花色素苷的相对含量在5—6月略微升高，嫩叶呈淡淡的紫红色；6—9月缓慢下降，达到最低值(2.28 mg/g)，成熟叶片呈绿色；10月花色素苷的相对含量上升，达到最高值(5.01 mg/g)，老叶变黄；11月下降。紫红叶鸡爪槭在5、8、10月含量较高，8月最高，达10.01 mg/g，叶片鲜艳，适宜观赏；6、9、11月含量低，9月最低，为3.12 mg/g，叶片颜色变成紫红色。

花色素苷含量和叶绿素含量的比值是评价叶色变化的标准之一，比值越大，叶片颜色越红[18]。由图1-E可知，紫红叶鸡爪槭的比值总是大于细叶鸡爪槭，细叶鸡爪槭的比值趋于稳定，而紫红叶鸡爪槭比值在每个时期都变化显著，11月达到最大值2.857，7月比值最小，仅0.789。

由图1-F可知，细叶鸡爪槭类黄酮的相对含量呈升—降趋势，紫红叶鸡爪槭呈降—升—降趋势。2种鸡爪槭都是11月含量最低，分别为5.35、5.59 mg/g；但细叶鸡爪槭7月含量最高，达到11.82 mg/g，紫红叶鸡爪槭5月含量最高，达15.98 mg/g。分析得知，2个品种的鸡爪槭在整个变色过程中类黄酮的相对含量没有显著性差异。

分析图1-G，在整个变色过程中，细叶鸡爪槭总酚的相对含量呈升—降趋势，紫红叶鸡爪槭呈降—升—降趋势。2个品种都是在11月含量最低，分别为30.46、43.74 mg/g；细叶鸡爪槭总酚含量最高在7月，达到76.46 mg/g，而紫红叶鸡爪槭最高在5月，达110.99 mg/g。分析可知，2种鸡爪槭总酚的相对含量变化没有显著性差异。

分析图1-H，在整个观察期，紫红叶鸡爪槭的可溶性糖含量均高于细叶鸡爪槭，呈升—降趋势。两者均在7月达到最高值，分别为9.26、6.09 μg/g；在11月降到最低，分别为2.35、1.64 μg/g。分析可知，2种鸡爪槭的可溶性糖含量在7—10月存在显著差异(P<0.05)。

由图1-I可知，细叶鸡爪槭的PAL活性呈降—升—降趋势，5月升至最高值，达到80.12 U/(g·h)，在8月时降到最低，只有6.80 U/(g·h)，紫红叶鸡爪槭则呈上升—下降趋势，8月份升到最高值157.05 U/(g·h)，11月则降到最低值4.45 U/(g·h)。分析可知，2种鸡爪槭的PAL活性呈显著负相关，两者间只有10月份差异不显著，其余时间差异极显著(P<0.01)。

由图1-J可知，在整个研究过程中，细叶鸡爪槭的ALA含量呈升-降趋势，5月含量最低，为38.29 μg/g，9月份升至最高，达到63.61 μg/g；而紫红叶鸡爪槭呈升—降—升变化趋势，5月含量最低，仅10.57 μg/g，7月含量最高，有 45.31 μg/g。整个调查期内细叶鸡爪槭的ALA含量均高于紫红叶鸡爪槭，两者间在5月份差异不显著，但在6、7月份差异极显著(P<0.01)。

由图1-K可知，2种鸡爪槭的PBG含量均呈升—降趋势，但细叶鸡爪槭的PBG含量最高在10月，达到 66.36 μg/g，最低在5月，为18.42 μg/g；而紫红叶鸡爪槭PBG含量最高在6月，达37.79 μg/g，最低在11月，降至 9.59 μg/g。只有在6月份的时候细叶鸡爪槭的胆色素原含量低于紫红叶鸡爪槭，其余时间都高于紫红叶鸡爪槭。2种鸡爪槭的PBG含量在5、7月差异不显著，在8—11月存在显著差异性(P<0.05)。

2.2 SRAP结果分析

2.2.1 DNA的提取 DNA的浓度和纯度用Spectrophoto meter ND-100全波长紫外分光光度仪进行检测，电泳图如图2所示。

2.2.2 引物的筛选 上下游引物各64条，共设计引物组合648对，其中246对引物组合初步筛选具有条带。按照多态性好、条带清晰、扩增稳定的原则进行引物的初步筛选[19]，筛选出的引物组合分别为FM18-RM33、FM19-RM10、FM20-RM14、FM20-RM32、FM20-RM46、FM20-RM60、FM43-RM37、FM25-RM43、FM44-RM14、FM44-RM30、FM44-GM39、FM44-RM47、FM54-RM16。

2.2.3 差异条带的切割和其引物组合 聚丙烯酰胺凝胶电泳共扩增出2 591条清晰的条带，其中1 093条细叶鸡爪槭、721条紫红叶鸡爪槭、777条血红枫。各个引物组合间存在较大差异，最多的可以扩增出高达15条带，最少的仅有1条。按照细叶鸡爪槭没有而紫红叶鸡爪槭和血红枫有，或细叶鸡爪槭有而紫红叶鸡爪槭没有的原则进行差异条带的选取，从所有扩增条带中切割出42条不同品种的差异条带，其中细叶鸡爪槭占40.48%，紫红叶鸡爪槭和血红枫的共同差异条带占5.52%。

2.2.4 二次PCR 二次PCR后筛选出13个单一且清晰的条带进行测序，拼接出6个条带的序列，详见表2。

表2 拼接序列引物

2.2.5 测序及其分析比对 用NCBI数据库进行核酸Blast数据比对分析，但由于没有完整的鸡爪槭数据库，所以只能进行相似序列的比对分析。比对结果显示：拼接出的6条序列没有发现同源序列，没有找到相对应的信息，说明这部分序列还没有相关研究，下一步可以作为研究的重点。

3 讨论

3.1 生理指标测定结果讨论

含水量反映了植物组织水分生理状况，直接影响植物的生长。检测鸡爪槭叶片含水量可知，2种鸡爪槭都是新鲜成熟叶片含水量高于老叶，这表明新陈代谢越旺盛，含水量越高，而植物叶片含水量与叶片颜色变化没有显著相关性。

植物叶片颜色一般由叶绿素和花色素苷的含量和分布决定[5]。本研究中细叶鸡爪槭的叶绿素总含量总是大于紫红叶鸡爪槭，所以细叶鸡爪槭叶片常年比紫红叶鸡爪槭绿。而2种鸡爪槭的花色素苷的相对含量变化趋势因品种不同而存在显著差异，当叶片中花色素苷含量占绝对优势时(60%～80%)，叶片呈红色[7]。但是胡敬志等认为花色素苷含量稳定，叶片pH值下降是叶片变红的主要原因[20]，这与前人的结论存在差异。

花色素苷和叶绿素的比值是评价叶色变化的标准，本研究中紫红叶鸡爪槭的比值在5、8、10、11月比值最大，此时叶片颜色最鲜艳；细叶鸡爪槭的比值趋于平稳，故叶色没有较大变化。由此可见，叶片变红程度与花色素苷含量与叶绿素含量比值呈正相关关系，这与前人的研究结果[21]一致。

有研究表明，花色素苷在多酚氧化酶、过氧化物酶、花色素苷酶等的作用下可以降解成酚类物质[22-24]，总酚是所有酚类物质，类黄酮也属于酚类。在本研究中，2种鸡爪槭的总酚和类黄酮含量变化没有显著差异，故与叶片颜色变化没有显著相关性。

可溶性糖是植物组织中所存储的营养物质，供植物生长发育使用，是植物代谢活动的主要参与者。赵建锋发现秋季植物体内一些复杂的有机物转化为糖类，直接促进了花青素的累积，叶片就呈现红色[25]。本研究中紫红叶鸡爪槭的可溶性糖含量随叶片变红而逐渐增加，而细叶鸡爪槭由于常年绿色，可溶性糖含量在整个观察期都低于紫红叶鸡爪槭，这与聂庆娟等的研究结果[26]一致，表明可溶性糖含量的增加可显著促进叶片中花色素苷的积累，进而影响叶片颜色变化。这与李倩等研究早熟桃叶叶色变化得到的结果[27]相同。

苯丙氨酸解氨酶是控制初级代谢转变为次级代谢的分支点，是形成酚类化合物中的一个重要调节酶[13]，而酚类物质的含量与花色素苷的降解有关。在本研究中细叶鸡爪槭的PAL活性随时间呈降—升—降变化趋势，紫红叶鸡爪槭则呈升—降的变化趋势，这可能是由于秋季花色素苷的大量合成消耗了大量的PAL[28]。2种鸡爪槭的PAL活性呈显著的负相关性，与叶色变化具有显著相关性。

叶绿素的合成分为4个阶段[29]，ALA和PBG都是叶绿素合成前期必不可少的物质，它们的含量与叶绿素含量正相关，ALA和PBG含量越低，叶片越红。

3.2 SRAP结果分析讨论

分子实验一共扩增出1 093条细叶鸡爪槭条带，721条紫红叶鸡爪槭和777条血红枫条带，其中筛选出42条特异性条带，最终选择来自13对引物组合的13条清晰稳定的差异条带进行测序，有6对引物组合测序成功。

由于槭树科植物没有数据库提供比对序列，只能进行相似序列的比对。结果没有找到相似度较高的同源序列，可能是因为目前没有该序列的相关研究，需要进一步深入研究；也可能是因为筛选的引物数量不够，还不足够说明问题，后续实验中可以加大引物筛选的数量以及差异条带的数量，选择出更有意义的序列。

4 结论

含水量和鸡爪槭叶色变化没有显著相关性。叶绿素含量越高，叶片颜色越绿。5-氨基酮戊氨酸和胆色素原与叶绿素的合成相关。ALA和PBG含量越低，叶片越鲜艳。花色素苷是叶片呈现红色的主要因素，含量越高叶片越红。可溶性糖的累积有利于花色素苷的合成，其含量越高，叶片越红。苯丙氨酸解氨酶是控制花色素苷合成的第1个但不是唯一的关键酶，是类黄酮和酚类化合物合成的关键酶和控制酶，其含量的高低和叶片颜色有显著的相关性，和花色素苷的含量呈一定的相关性，所以变色期紫红叶鸡爪槭要比细叶鸡爪槭鲜艳。