利用复合酶结合超声法提取沙棘叶黄酮

陈 春

(山西省林业科学研究院，山西 太原 030012)

1 引言

沙棘(HippophaerhamnoidesLinn.)是胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属(HippophaeLinn.)多年生灌木。沙棘富含多种营养成分和活性物质，其中沙棘黄酮具有抗氧化延迟衰老、增强免疫功能、调节血糖血脂、抑制肿瘤生长、抗心血管疾病等药理作用[1]。研究表明沙棘叶黄酮含量明显高于果实，并且沙棘叶利用成本远低于沙棘果实[2]。

黄酮主要的提取方法包括：水提取法、有机溶剂提取法、微波辅助提取法[3]、超声波辅助提取、酶提取法等[4～6]。本研究将乙醇提取法、超声辅助提取法[7]和复合酶提取法[8]相结合，目的是通过实验获得最佳的提取工艺条件，为沙棘叶黄酮提取的生产和研究提供参考。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 沙棘叶片

沙棘叶片采摘于山西省关帝山国有林管理局三道川中心林场龙兴工区。

2.1.2 实验用试剂和酶

本实验主要试剂包括：芦丁标品，批号: 100080-200707，中国药品生物制品检定所；复合酶由宁夏和氏璧生物技术有限公司生产；果胶酶由国药集团化学试剂有限公司生产；其它试剂均为分析纯试剂。

2.1.3 实验仪器

实验过程中主要用到的仪器设备有：GZX-9070MBE电热鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司)；QE-500高速粉碎机(浙江屹立工贸有限公司)；SB25-12超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；721紫外可见分光光度计(上海第三分析仪器厂)。

2.2 试验方法

2.2.1 样品的预处理

将采摘的沙棘叶置于干燥箱中，在60 ℃温度条件下干燥24 h，取出干燥后的沙棘叶片去掉小枝，用粉碎机将沙棘叶片粉碎后过40目筛，装入样品袋，放入干燥器中保存备用。

2.2.2 标准曲线的制作

2.2.2.1 对照品标准溶液配制

总黄酮对照品标准溶液的制备：用万分之一天平上称取芦丁20 mg,用60%乙醇将芦丁通过水浴微热使溶解于100 mL容量瓶中,加适量,冷却至室温后,继续添加60%乙醇定容，得到芦丁浓度为0.2 mg/mL标准溶液。

2.2.2.2 标准曲线的制作

吸取0.2 mg/mL芦丁标准溶液0 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL于25 mL容量瓶,依次分别加入30%乙醇至6 mL、5 mL、4 mL、3 mL、2 mL、1 mL、0 mL，摇匀；继续加入1 mL的5%NaNO2溶液,摇匀后静置6 min；加入1 mL的30%Al(NO3)3溶液,摇匀静置6 min；最后加入10 mL的10%NaOH溶液,加30%乙醇至刻度,摇匀静置15 min。在波长为510 nm处测定吸光度。曲线X轴为芦丁的梯度浓度值,Y轴为对应的吸光度值,绘制标准曲线。

2.2.3 沙棘总黄酮含量测定

将沙棘叶黄酮提取的液渣混合物过滤除去叶渣，用移液枪吸取1 mL提取液于25 mL容量瓶,然后利用亚硝酸钠-硝酸铝-氢氧化钠法在波长为510 nm条件下测定吸光度。根据样品中黄酮含量(mg/g)=(c×d×v)/r的公式计算，c为通过标准回归方程计算所得质量浓度(mg/mL),d为稀释倍数,v为提取液总体积(mL)，r为沙棘叶粉的重量(g)。

2.2.4 沙棘叶提取单因素影响试验

2.2.4.1 用酶量对沙棘叶黄酮提取的影响

称量沙棘叶粉0.5 g，液料比20∶1,加入60%乙醇10 mL,超声功率200 W,提取温度50 ℃,提取时间60 min,酶用量分别是沙棘叶粉质量的1%、2%、3%、4%、5%和6%的梯度条件下提取沙棘叶总黄酮。

2.2.4.2 温度对沙棘叶总黄酮提取的影响

称量沙棘叶粉0.5 g，液料比为20∶1，加入60%乙醇10 mL,设置超声功率200 W,提取时间60 min,提取用酶质量百分比为沙棘叶粉质量的4%，在提取温度20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃的梯度温度下提取沙棘叶总黄酮。

2.2.4.3 时间对沙棘叶总黄酮提取的影响

称量沙棘叶粉0.5 g，液料比为20∶1，加入60%乙醇10 mL,设置超声功率200 W,酶质量百分比为沙棘叶粉质量的4%，提取温度50 ℃,在提取时间为20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min、 80 min的梯度条件下提取沙棘叶总黄酮。

2.2.4.4 超声功率对沙棘叶总黄酮提取的影响

称量沙棘叶粉0.5 g，液料比为20∶1，加入60%乙醇10 mL,酶质量为沙棘叶粉质量的4%，提取温度50 ℃,提取时间为60 min，分别设置超声功率为200 W、250 W、300 W、350 W、400 W、450 W、500 W梯度条件下提取沙棘叶总黄酮。

2.2.4.5 液料比对沙棘叶总黄酮提取的影响

称量沙棘叶粉0.5 g，酶质量为沙棘叶粉质量的4%，提取温度50 ℃,提取时间为60 min，设置超声功率为200 W，在液料比为10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1梯度条件下提取沙棘叶总黄酮，即分别加入60%乙醇5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL。

2.2.4.6 乙醇浓度对沙棘叶总黄酮提取的影响

称量沙棘叶粉0.5 g，酶质量为沙棘叶粉质量的4%，提取温度50 ℃,提取时间为60 min，设置超声功率为200 W，在液料比20∶1，分别加入10 mL体积百分比浓度分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%的乙醇提取沙棘叶总黄酮。

2.3 数据处理与分析

本实验利用软件Origin2017软件处理分析实验数据并绘制数据图。

3 结果与分析

3.1 标准曲线的绘制

如图1所示即为芦丁吸光度标准曲线，由软件origin 2017经线性回归得回归方程y=-7.03571E+12.1799X，相关系数R2=0.99937，在0.008 mg/mL～0.06 mg/mL区间范围内线性回归关系良好。

3.2 单因素试验结果分析

3.2.1 提取用酶量对沙棘叶黄酮提取的影响

如图2所示，通过在超声辅助条件下利用乙醇对沙棘叶黄酮的提取过程中，添加酶会有效提高沙棘叶黄酮的提取效率，通过改变酶相对于沙棘叶粉的质量百分比，进一步研究沙棘叶黄酮提取效率同酶用量的关系。从图2可知，添加复合酶5%时，提取效率最高，添加果胶酶6%时，提取效率最高。

图1 芦丁吸光度标准曲线

图2 酶质量百分比对沙棘叶总黄酮提取的影响

3.2.2 温度对沙棘叶总黄酮提取的影响

由图3可以看出，提取沙棘叶黄酮时无酶添加情况下，随着温度的升高沙棘叶黄铜的析出逐渐增大，当提取温度增加至60 ℃时再继续增加温度对提取率变化不明显。在添加复合酶和果胶酶单酶的条件下，温度为50 ℃，提取率均达到最大，之后由于温度的升高让酶的蛋白质结构发生变性影响到对酶解反应的生物催化作用，提取率呈下降趋势。

图3 温度对沙棘叶总黄酮提取的影响

3.2.3 时间对沙棘叶总黄酮提取的影响

由图4可以看出，随着提取时间的延长，沙棘叶总黄酮析出量将不断增大，当达到70 min以上时，沙棘叶总黄酮含量将再基本保持不变。从图中可以看出，当提取时间为60 min时，添加复合酶和果胶酶，提取黄酮的含量均达到最大值，并且添加复合酶的提取效率高于果胶酶。

图4 时间对沙棘叶总黄酮提取的影响

3.2.4 超声功率对沙棘叶总黄酮提取的影响

由图5所示，根据超声的功率设定范围从200～500 W，从图中可以明确看出在使用酶辅助的条件下沙棘叶黄酮提取率高于无酶添加，并且复合酶的提取效率高于单酶果胶酶，均在300 W时达到最大提取效率。

图5 超声功率对沙棘叶总黄酮提取的影响

3.2.5 液料比对沙棘叶总黄酮提取的影响

由图6所示，添加复合酶辅助提取沙棘叶黄酮时当液料比为30∶1时，提取效果最好；使用果胶酶时液料比为20∶1提取率最高。无酶添加时随着液料比的增加，沙棘叶黄酮提取效率不断增加，当达到液料比为40∶1和50∶1时基本没有变化。

图6 液料比对沙棘叶总黄酮提取的影响

3.2.6 乙醇分数对沙棘叶总黄酮提取的影响

由图7可知，在使用生物酶辅助提取沙棘叶黄酮的过程中，随着乙醇体积分数的增加，沙棘叶黄酮的析出均是先快速提高，复合酶在乙醇体积浓度为50%，果胶酶在30%达到最大提取效率，然后再缓慢降低，主要原因是高浓度的乙醇能使蛋白变性从而使酶失去活性。在无酶条件的对照组可以看出，随着乙醇浓度升高沙棘叶黄酮的提取效率呈正相关，但当乙醇的体积分数为70%，随着乙醇体积分数增加沙棘叶黄酮提取效率基本不变。

图7 乙醇体积分数对沙棘叶总黄酮提取的影响

3.3 单酶和复合酶对沙棘叶黄酮提取的对比

从图3～7的多个单因素对沙棘叶黄酮提取影响的对比实验可以看出，提取沙棘叶黄酮过程中添加酶可以有效提高沙棘叶中黄酮的提取率，同时添加复合酶对沙棘叶总黄酮的提取要明显优于添加果胶酶单酶。

4 讨论与结论

(1)通过将乙醇提取法、超声提取法、酶提取法3种沙棘叶提取方法结合，可以有效提高沙棘叶黄酮的提取效果，并且不会引入有毒有害物质，提取液易于分离回收，具有很好的生产实践意义。

(2)通过实验优化后的提取条件：使用复合酶，酶质量百分比5%，时间60 min，超声功率300 W，温度50 ℃，乙醇体积分数50%，液料比30∶1。在优化后的提取条件下，提取沙棘叶黄酮。在优化后的提取条件下，提取沙棘叶总黄酮，最后的得率为1.78%。

(3)通过两种不同的酶作用于沙棘叶，复合酶和果胶酶。其中复合酶成分包括果胶酶、半纤维素酶、阿拉伯聚糖酶、β-葡聚糖等酶，由于酶之间有较强的协同作用，相互促进，加速细胞结构的分解，促进黄酮类物质进一步释放，复合酶提取沙棘叶黄酮的效果优于果胶酶单酶。因此在相同的条件下优选添加复合酶作为辅助来提取沙棘叶总黄酮，可以节约酶的使用量，降低提取成本，提高提取沙棘叶黄酮的提取率。

ExtractionofFlavonoidsinSeaBuckthornLeavesbyUsingCombinedEnzymeAssistedwithUltrasonicMethod

Chen Chun

(ShanxiAcademyofForestSciences,TaiyuanShanxi, 030012,China)

Abstract: Sea buckthorn (Hippophaerhamnoides L.) leavesare rich in many active components,among which the flavonoids have high health care and medical value.In this study, the total flavonoids in the leave of Sea buckthorn are extracted by using the combined enzyme assisted with ultrasonic method. Through the single-factor experiments, the extraction of flavonoids in leaves has been optimized. The experiment results indicate that the optimum extraction conditions for flavonoids aremass percentage of the combined enzyme 5%,60min, ultrasonic power300w, temperature50℃, ethanol volume fraction 50%, and liquid-solid ratio30:1. The experiment also shows extraction efficiency of combined enzyme is significantly higher than individual enzyme.

Keywords: sea buckthorn leaves;Flavonoids; ultrasonic method; complex enzyme