电针对慢性应激抑郁大鼠海马区突触可塑性和 神经源性一氧化氮合酶的影响❋

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(南京中医药大学，南京 210023)

抑郁症是以情绪低落、思维迟缓、意识活动减退为主要特征的情感性精神障碍性疾病，常伴有相应的思维和行为改变[1]。在抑郁症的发病过程中，神经源性一氧化氮合成酶(neuronal NO synthase, nNOS)扮演着重要角色。在抑郁症患者尸检后发现，其蓝斑内nNOS水平较正常人偏低[2]，但也有研究发现，额叶nNOS表达水平出现上升[3]。海马作为影响情绪反应的重要脑区，其nNOS表达水平的上调对抑郁症的发生更是起到重要作用[4]。当前研究认为，nNOS参与一氧化氮的产生、释放、扩散和失活过程[5]，其功能异常会导致脑内pH值的降低[6]，影响突触数量和结构完整[7]，从而出现抑郁症状。

实验与临床证明，电针抗抑郁疗效确切[8-9]。我们团队的前期研究中发现，电针抗抑郁升高了海马中脑源性神经营养因子含量[10]，促进了神经可塑性的发展[11]，从而改善了抑郁行为[12]。由于nNOS影响神经元突触可塑性，故而团队认为电针可能通过nNOS介导神经可塑性的发展，从而实现对抑郁行为的改善。本研究以此为假说，探讨电针抗抑郁的nNOS介导突触可塑性机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 雄性SPF级SD大鼠，体质量(180±220) g，购自上海西普尔-必凯实验动物资源中心(许可证号SCXK(沪)2013-0016)，饲养温度22±1 ℃，实验前饲养1周适应环境。

1.1.2 实验仪器 敞箱及摄像头(TopScan-动物行为智能分析系统，Cleversys，美国)，PM-200视频跟踪系统(成都泰盟科技有限公司)，韩氏电针仪(LH202，北京卫华有限公司)，超薄切片机(Tome-Power XL)，HITACHI H-7650透射电子显微镜(日本日立公司)。

1.2 实验方法

1.2.1 分组、造模及干预方法 采用随机数字表法选择20只大鼠作为正常组，其余80只大鼠根据文献[13]造模方式进行慢性温和不可预见性应激(chronic and unpredictable mild stress,CUMS)21 d造模处理，并单笼孤养。CUMS造模即在孤养的同时对大鼠进行不可预见的应激。按照足底电击5 min，夹尾3 min，45 ℃热水游泳4 min，禁食+昼夜颠倒，水平震荡5 min禁水，10 ℃冷水游泳5 min应激。以上应激因素采用随机原则，使大鼠不能预料刺激的发生,每日1次，平均每种刺激每7 d进行1次。造模后于第22天进行旷场实验后按运动总距离排序，剔除运动总距离与正常组差异最小的25%大鼠。剩余大鼠按照随机数字法分为模型组、假电针组和电针组。

正常组4只一笼群养，不给予任何干预。模型组造模21 d并孤养。电针组于造模21 d后参照《实验动物针灸穴位图谱》[14]取“百会”“印堂”穴，使用华佗无菌针灸针(0.35×13 mm)向后平刺5～8 mm，针柄接韩氏电针仪，连续波2 Hz，1.0 mA，留针15 min，每日1次，连续治疗14 d。假电针组用胶布固定针体于穴位处皮肤不通电，其余同电针组。

1.2.2 旷场实验 所有造模与治疗结束后1 d，大鼠适应安静暗光环境1 h后将其放置于敞箱中央，正上方摄像头及PM-200视频跟踪系统记录大鼠5 min内的运动总距离、中心区停留时间以及进入次数。每只大鼠实验结束取出后清理敞箱，并用75%的酒精去除气味。

1.2.3 透射电镜 大鼠灌注后断头，取出海马CA1区组织1 mm3，与2.5%戊二醛溶液内进行固定4 h。0.1 mol/L磷酸内漂洗3次，15 min/次。1%锇酸固定液固定2～3 h，丙酮梯度脱水，于4 ℃环境各脱水15 min，组织加环氧树脂包埋，超薄切片机制作80 nm切片，醋酸铀、柠檬酸铅染色。在透射电镜下观察并拍照。观察时随机选取6个完整网孔，每个样本在4000～6000×镜下观察细胞形态以及突触数量，10000～20000×倍镜下观察突触超微结构并拍照8～10张，选择2个较为清晰的网孔在6000×镜下统计单个视野中完整突触平均数量。

1.2.4 蛋白免疫印迹法(western blot) 将大鼠海马组织置液氮罐中速冻后，转移至-80 ℃冰箱内保存。取海马组织100 mg，加裂解缓冲液1 ml和苯甲基磺酰氟(PMSF)10 μL，充分研磨后离心取上层清液，BCA蛋白浓度测定法测定蛋白浓度。样品蛋白变性后，取样品蛋白50 μg，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，封闭2 h后，分别加LIMK1一抗、Anti- LIM kinase 2(phospho T 505)+LIMK1(phospho T 508)一抗(1∶1000)、β-actin一抗(1∶1000)孵育，4 ℃过夜；辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育1 h。将 PVDF膜放于图像扫描仪上，避光配置显色液并覆PVDF膜1 min。Image-lab图像分析系统(BIO-RAD，美国)分析，以β-actin为内参，计算目的蛋白相对灰度。

1.2.5 荧光定量聚合酶链反应(Real time-PCR) 引物设计与合成由南京金斯瑞科技有限公司完成。引物序列：nNOS引物序列：forward， 5’-TGT CCT ATA CAG CTT CCA GA-3’；reverse，5’-CAC GAT GTC ATA TTC CTCCA-3’；内参β-actin引物序列：forward，5’-CAC GAT GGA GGG GCC GGA CTC ATC-3’；reverse，5’-TAA AGA CCT CTA TGC CAA CAC AGT-3’。扩增条件：94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，周期为30个循环，最后72 ℃延伸45 s。每个样品做3个平行孔取平均值，获得平均CT值，以β-actin作为内参照校正，用2-△△CT值表示基因的相对表达水平。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 旷场实验测试结果

表1显示，与模型组比较，电针组大鼠运动总距离、中心区进入次数及中心区进入时间都有明显上升(P<0.05)，假电针组未见变化(P>0.05)。

表1 各组大鼠旷场实验测试结果

注：与正常组比较:aP<0.05；与模型组比较:bP<0.05

2.2 大鼠海马CA1区突触数量与结构变化

表2显示，与正常组比较，模型组与假电针组大鼠海马CA1区完整突触结构数量明显减少(P<0.05)，电针组大鼠海马CA1区完整突触结构数量较多，与模型组比较有明显增多(P<0.05)，与正常组比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 各组大鼠海马CA1区完整突触结构数量比较(个/6000×视野，

注：与正常组比较:aP<0.05；与模型组比较:bP<0.05

图1显示，透射电镜观察神经元细胞结构、线粒体结构、髓鞘结构、突触超微结构以及同一视野突触分布。图中从左至右4图分别代表正常组、模型组、假电针组和电针组。

注：A.神经元细胞结构(15000×)；B.线粒体结构(15000×)； C.髓鞘结构(7000×)；D.突触超微结构(20000×)； E.同一视野突触分布(6000×)图1 各组大鼠海马CA1区神经元超微结构比较(HITACHI H-7650透射电子显微镜)

透射电镜观察显示，与正常组比较，模型组与假电针组大鼠海马CA1区神经元细胞核出现固缩现象，细胞核膜皱缩；线粒体嵴变形，出现肿胀甚至破裂现象；髓鞘壁变薄、松散，新生髓鞘数减少。完整突触结构数量减少，突触前膜囊泡数量减少，染色浅淡，前后膜边界不清，后膜致密物质稀疏，活性区长度短。

电针组大鼠海马CA1区神经元细胞核完整，染色均匀，细胞核膜无明显皱缩，线粒体结构正常完整，线粒体嵴结构正常。髓鞘壁致密、较厚，新生髓鞘数较多。同一视野中完整突触结构数量较多、分布较密，突触前膜囊泡数量多，染色深，前后膜边界清晰，后膜致密物质浓厚，且出现长度较长的活性区。

2.3 大鼠海马nNOS蛋白及nNOS mRNA表达水平

表3图2显示，模型组大鼠海马nNOS蛋白及nNOS mRNA表达水平较之正常组明显增高(P<0.05)，与模型组比较，电针组nNOS蛋白及nNOS mRNA表达水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)。假电针组与模型组之间比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 各组大鼠海马nNOS蛋白及nNOS mRNA表达 水平比较

注：与正常组比较:aP<0.05；与模型组比较:bP<0.05

图2 各组大鼠海马nNOS表达水平蛋白印记比较

3 讨论

CUMS模型是一种理想的抑郁动物模型，最早由Willner P于1987年应用[13]。该模型模拟了与人类抑郁症发生机制相似的环境诱因，被广泛应用于抑郁模型的实验中[15]。近年抑郁症研究显示，造模后大鼠的旷场实验评分、大鼠体质量及糖水消耗量都有明显下降[16-18]，由此可见CUMS是可靠的抑郁造模方式。

抑郁症属于中医“郁证”范畴，多责之于脑神紊乱[19]。督脉所属穴位多可治疗脑部疾病，故有“病变在脑，首取督脉”之说。“印堂”“百会”位于督脉，是临床治疗抑郁症的常用腧穴。已有证据证明，电针可以有效改善抑郁症的核心症状[20-21]且副作用较小。电针“印堂”“百会”配合药物5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)的临床试验中[22]，针刺联合SSRIs治疗较单纯口服SSRIs可更快、更有效地缓解抑郁障碍患者抑郁程度。另一方面，动物实验表明，电针“印堂”“百会”后动物自发运动[23-24]恢复正常，且突触超微结构[25]也趋于正常，证明在动物实验中，电针“印堂”“百会”可以改善抑郁症模型动物行为学，且可能与电针调整改善突触超微结构相关。

旷场实验是较为公认的评价动物抑郁行为的实验[26]。CUMS大鼠在旷场实验中的评分趋势与强迫游泳、糖水消耗实验等经典实验同样能反映大鼠的抑郁行为[27-29]。旷场实验指标与海马的一系列变化具有相关性，从一定程度上能反映海马的变化[30]。本实验通过观察旷场实验的3个重点指标，即运动总距离、中央区进入次数与中央区停留时间来评估抑郁症模型大鼠行为学的改变。这3个指标数值下降，说明大鼠对新环境的探索发现、兴奋好奇及适应能力下降[31]，表现出类似抑郁状态。其中运动总距离结果代表了动物的自发活动度，中央区进入次数和中心区停留时间结果都可代表趋避性的强弱，中央区进入次数表达动物在相对安全的情况下是否仍具有探索意愿。

海马与抑郁行为的发生密切相关[32]。环境压力的变化会在许多方面影响海马的突触可塑性，外界压力会减少海马神经元的树突数目，改变海马神经元的体积以及引起海马神经元的凋亡，进一步影响海马内部环路的可塑性[33]。从突触结构角度看，nNOS表达水平的改变也可以带来神经元细胞和突触结构的一系列变化，如影响线粒体的活性和分布密度[34]、突触形成和稳定性[35]、神经元细胞和突触结构的完整[7]等。

图3显示，实验结果初步证实了我们的假说，电针可以改善CUMS大鼠模型的抑郁症状，其机制与经nNOS介导、影响海马CA1区突触可塑性相关。

图3 电针对CUMS大鼠海马nNOS表达水平以及海马CA1区 突触可塑性影响相关机制示意图

综上，电针治疗抑郁症是通过nNOS介导、影响海马CA1区突触可塑性，从而治疗抑郁症核心症状并达到治疗目的。