自然淹水后疏花水柏枝多酚类物质含量及抗氧化能力变化分析

刘宇烁　孔玉珊　田伟　蔡利鹏　谢小兵

摘 要 疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）特异分布于三峡消涨带地区，对涝害具有较强的适应性，能耐受因低氧导致的氧化胁迫。本研究应用福林酚试剂法分析了自然淹水前后疏花水柏枝不同组织部位多酚类物质的含量，并用体外活性检测和体内评价相结合的方法，比较了淹水胁迫前后的抗氧化能力差异。结果表明疏花水柏枝多酚含量丰富，而且其提取物具有较强的抗氧化能力，对大肠杆菌的氧化损伤具有明显的保护作用；淹水后多酚含量、总抗氧化能力、体内抗氧化活性均显著低于淹水前的各组织，特别以叶片部位下降幅度最大。分析表明，自然淹水胁迫前后疏花水柏枝的多酚含量、体外抗氧化活性、体内抗氧化保护三者之间存在一定的相关性，表明多酚类物质作为疏花水柏枝抗氧化活性的主要物质之一，参与了其对淹水脅迫的生态适应。

关键词 疏花水柏枝 淹水胁迫 多酚 抗氧化

涝害是一种阻碍植物生长发育的重要胁迫因子，严重影响着全球的农林业生产。据统计，世界上约12%的耕地受涝害影响，在我国仅黄淮平原和长江中下游地区，每年平均有7.3？07 hm2受到涝灾。近年来随着全球气候变化，涝害发生的频率、持续时间和受灾面积呈逐年上升趋势。

探索植物对淹水胁迫的适应机理，促进农林业可持续发展，一直是植物学研究领域的一大热点。人们对分布在涝渍地区的物种开展研究，分析其生态适应性，探索其抗水分胁迫能力的机制，并将之推广应用，是提高植物抗涝害胁迫能力的一种有效方法。疏花水柏枝（Myricaria laxiflora）特异分布于三峡消涨带地区，系一种柽柳科（Tamaricaceae）水柏枝属（Myricaria）灌木。由于常遭受季节性的洪水淹没，该物种对低氧环境显示出较强的耐受性，进化出较强的抗氧化能力。十年前有学者预测它将因三峡大坝的建成而灭绝，可是近年来人们发现，在大坝下游河滩或江心小岛也有少量疏花水柏枝分布，说明该物种在漫长的生态适应过程中，进化出较强的抗氧化损伤和水淹胁迫能力。

近年来研究表明，淹水导致的氧化胁迫和活性氧自由基积累是导致其生长发育受阻的重要原因。一些抗逆性较强的植物，可以通过抗氧化保护酶类和抗氧化小分子物质来调节活性氧的平衡状态。而植物体的多酚类化合物（polyphenols）因其出色的抗氧化活性引起了人们的广泛关注，它是一类有多个酚羟基的次生代谢产物，结构多样，分布广泛。随着物质分离鉴定技术的发展，人们已分离鉴定出了千余种多酚类化合物，主要包括酚酸类、二苯乙烯、黄烷酮类及木质素等化合物。

为了进一步明确多酚类物质在疏花水柏枝水淹胁迫和抗氧化代谢中起的作用，本研究以自然淹水胁迫前后的疏花水柏枝的不同组织为研究对象，分析了其多酚类物质的含量，评价了其抗氧化能力在淹水条件下的变化规律，为明确多酚类物质在植物涝害胁迫中的作用奠定基础。

1材料与方法

1.1植物组织材料及处理

新鲜的疏花水柏枝样品取自三峡河岸带宜昌胭脂坝地区，东经109？2'-110？2'，北纬30？53'N - 31 ？'N。取淹水前（7月）后（10月）的疏花水柏枝（如图1）根、茎、叶干燥并粉碎，准确称量50 g后放入圆底烧瓶中，分别加入80%乙醇溶液200mL，回流提取3次，2h/次，合并三次提取液，过滤，减压低温浓缩，再用80%乙醇溶解，过滤并定容至200mL，使用时稀释20倍。分别测定其多酚含量和抗氧化值，每组5个重复。

1.2多酚含量测定

由于多酚类化合物分子上有极易氧化的羟基，而Folin-Ciocalteu试剂中的钨钼酸可以在碱性条件下将其氧化成蓝色化合物，该物质在765 nm处有最大的光吸收，从而可用于精确测量。Folin-Ciocalteu试剂：于500 mL的圆底烧瓶中加入钼酸钠12.5 g、钨酸钠50 g、倒入蒸馏水350 mL、浓盐酸50 mL、85%的浓磷酸25 mL，冷凝回流处理10个小时，移去冷凝管，待溶液稍冷却以后添加75 g的硫酸锂和滴入数滴溴水，使烧瓶开口继续维持沸腾的状态15 min，用以除去多余的溴。结束回流，待溶液冷却以后，定容到500 mL，滤纸过滤，转入棕色试剂瓶中，4 ℃冰箱中冷藏备用，使用时需稀释一倍。

以没食子酸为标准溶液制作多酚测定的标准曲线。先用80%乙醇溶解10 mg的没食子酸并定容至100 mL，然后将不同浓度梯度的没食子酸溶液置入比色管中，加入1.5 mL Folin-Ciocalteu试剂，8 min后加入4.5 mL 10% Na2CO3溶液，用蒸馏水定容至25 mL，在25℃下水浴2 h，蒸馏水作为空白对照，在765 nm波长下测定吸光值。各样品多酚的测定方法同上，对照标准曲线，计算多酚含量。

1.3总抗氧化能力（T-AOC）测定

采用总抗氧化能力（T-AOC）测定试剂盒（南京建成公司）对各粗提物进行测定，利用抗氧化物质能使Fe3+还原成Fe2+，后者可与菲啉类物质形成稳固的络合物，通过520nm 测定的吸光度可测出其抗氧化能力的高低，具体操作按照产品说明书进行。在37℃时，每分钟每毫升使反应体系的吸光度（OD）值每增加0.01 时，定义为一个总抗氧化能力单位，样品总抗氧化能力计算公式如下：

式中，ODu为测定管OD值；

ODc为对照管OD值；

N为样品稀释的倍数（反应液总量/取样量）；

n为样本测试前稀释的倍数。

1.4提取物对对大肠杆菌抗氧化保护作用

采用本实验室建立的过氧化氢氧化损伤模型来分析提取物对大肠杆菌抗氧化保护作用。将250mL摇瓶中处于对数生长期的大肠杆菌菌液中分别加入3mL浓度为mg/mL的粗提物，培养24h后，加入终浓度为0.2mM的H2O2溶液，再培养12h，然后取1mL大肠杆菌菌液稀释到106，取0.5mL涂布于培养皿中，12h后计数并计算存活率。用1mg/mL的维生素C做正对照，每组数据重复5次。

1.5统计分析

实验数据以x眘表示，5个重复，数据分析采用SPSS 19.0 统计软件。

2结果与分析

2.1疏花水柏枝多酚类物质在淹水前后的变化

首先根据没食子酸的浓度梯度绘制多酚测定的标准曲线，纵坐标为765 nm下的吸光值，横坐标为标准溶液的浓度。标准曲线如图2所示，其线性关系为：Y = 0. 0214x + 0. 013，线性相关系数为0. 9992，表明没食子酸浓度在0～50%eg/mL范围内与其吸光值呈良好的线性关系（如图2）。

根据获得的标准曲线测定了疏花水柏枝在淹水前后不同部位多酚类物质，结果显示在疏花水柏枝的不同部位均有较丰富的多酚类物质，而且淹水胁迫导致其根、茎、叶部位的多酚含量显著下降，尤以叶片下降的幅度最大，降幅达到80%（表1），根和茎次之，降幅分别达到33.6%和25.9%，表明多酚类物质参与了疏花水柏枝的淹水胁迫代谢。

2.2疏花水柏枝淹水前后体外抗氧化能力分析

为了测定淹水胁迫对疏花水柏枝抗氧化能力的影响，实验采用总抗氧化试剂盒测定了淹水前后不同组织部位的体外抗氧化能力，结果表明根、茎、叶的抗氧化值在淹水后均发生了显著下降。但是不同组织部位下降的幅度不一样，与多酚类物质的含量类似，尤以叶片部位的抗氧化值下降得最为明显，只有淹水前的17%（如图3）。

均采用淹水前后的数据对比进行显著性分析，* P<0.05，**P<0.01， n=5

2.3体内抗氧化能力分析对大肠杆菌的抗氧化保护作用

由于不同抗氧化能力测定方法可能有一定的差异，为了进一步明确疏花水柏枝不同部位的抗氧化能力，我们利用大肠杆菌为实验材料，用0.2mM的H2O2溶液模拟氧化损伤，进行了体内抗氧化保护实验。结果表明在淹水胁迫前，疏花水柏枝淹水前的各组织部位均有较好的抗氧化保护效果，能有效保护过氧化氢导致的氧化损伤，其中根部的效果最好，与正对照Vc的保护效果相当（如图4）。值得一提的是，大多数样品均可促进大肠杆菌的正常生长，其生长状态明显优于空白组（不加H2O2），反映疏花水柏枝的提取物可以促进细菌的增殖。淹水后各部位对大肠杆菌的抗氧化保护作用均出现了下降，与多酚类物质的下降趋势类似，尤其以叶部下降的幅度最大，达到94%（如图4）。

前根：淹水前的根部；后根：盐水后的根部。采用Duncan 多重比较分析，P<0.05，n=5

将体内和体外的两种抗氧化测定方法进行了相关分析，结果发现两者存在一定的正相关，相关系数达到0.7923（如图5），表明两种测定方法一定程度上可以相互验证。

2.4多酚类含量与抗氧化值的相关分析

为分析疏花水柏枝的多酚类物质在抗氧化代谢中起到的作用，我们进行了淹水前后多酚类物质含量与体外及体内抗氧化活性的相关性。结果表明不管是总抗氧化值还是对大肠杆菌的氧化损伤保护作用，疏花水柏枝的多酚类物质与之都存在一定程度的正相关，其中与总抗氧化值的相关系数达到0.7679（如图6），與体内的抗氧化活性相关系数达到0.6336，反应疏花水柏枝的多酚类物质是其起到抗氧化作用的主要物质之一。

3结论与讨论

3.1结论

疏花水柏枝的不同组织部位多酚类物质含量丰富，而且其提取物具有较强的抗氧化能力，对大肠杆菌的氧化损伤具有明显的保护作用。淹水状态将影响其多酚含量、总抗氧化能力、体内抗氧化活性，淹水后将显著降低，尤以叶片部位下降幅度最大。自然淹水胁迫前后疏花水柏枝的多酚含量、体外抗氧化活性、体内抗氧化保护三者之间存在一定的相关性。

3.2多酚类物质在植物体抗氧化代谢中的作用

疏花水柏枝的抗氧化能力与所含多酚类物质的含量之间具有一定的相关性，暗示多酚类物质可能作为疏花水柏枝抗氧化活性的主要物质之一，帮助植物顺利的度过淹水导致的氧化胁迫。本实验室从疏花水柏枝体内分离出一种酚类主物质，3，4-二甲氧基-5-羟基苯甲酸甲酯，显示有较强的抗氧化活性，能有效保护神经细胞免于氧化损伤，从侧面证实了疏花水柏枝的酚类物质在抗氧化代谢中起到了重要作用。

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