Box-Behnken响应面法优化辣木叶蛋白超声提取工艺研究

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(1. 齐齐哈尔大学，齐齐哈尔 161006；2. 中国标准化研究院，北京 100191；3. 北京市理化分析测试中心，北京 100089)

1 引言

辣木(MoringaoleiferaLam)是一种具有较高经济价值的热带植物[1]，其叶片营养丰富，富含维生素、叶酸、泛酸、钙、铁、硒等营养物质[2]，尤其是其中的植物蛋白含量通常可达15%，是酸奶的2倍[3,4]；且其蛋白质中所含的必需氨基酸高于FAO/WHO/UNO对2～5岁儿童推荐的最适氨基酸摄取量[5]。因此，辣木叶是目前已知的最好的植物蛋白来源之一。辣木叶中蛋白质常用的提取方法主要有超声提取法[6-8]、碱提取法[9]、酶提取[10,11]、膜过滤法[12]，其中超声提取法凭借操作简单、省时省力、绿色环保的优势被广泛使用。

响应曲面设计方法(Response Surface Methodology，RSM)由George E. P. B.和Wilson K. B.于1951年提出[13]。它的核心是利用合理的试验设计方法设计一系列实验，得到一定量的数据，通过多元二次回归方程探讨拟合因素和响应变量之间的关系，获得各因素的最优参数，解决多变量问题[14]。响应面法具有试验设计合理、精密度高、预测性能好，能研究几种因素间交互作用等优点[15]，得到了许多研究人员的关注和应用，近年来已被广泛应用于精细化工[16,17]、机械加工[18]、农业[19]等领域。

本实验重点研究了干燥辣木叶中蛋白质的超声提取工艺，通过单因素试验的方法考察了pH值、料液比、超声功率、提取温度和提取时间5个因素对辣木叶中蛋白质的提取效率的影响；然后利用Design Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken模型对辣木叶中蛋白质的提取条件进行优化，通过分析总结确定了辣木叶中蛋白质的最佳提取工艺，该方法得率较高，具有较好的应用前景。以此工艺条件对市售的76种辣木叶制品中的蛋白质进行提取和分析。该方法为辣木叶在保健食品领域的应用提供技术支持。

2 材料与方法

2.1 材料和试剂

云南、广东、广西、福建、四川等不同产区随机抽样26个辣木叶样品，19个辣木叶干粉样品，31个辣木茶样品，各取500 g至于50 ℃烘箱中，烘干后取出粉碎，过80目筛，制成辣木叶粉备用。

牛血清白蛋白(生化纯)，浓硫酸、氢氧化钠、盐酸、考马斯亮蓝G250，均为分析纯，均购自国药集团化学试剂有限公司；超纯水为实验室纯水机自制。

2.2 仪器设备

QFN-5200DTS超声清洗器(上海观谋事业有限公司)；Eppendorf Research移液器(量程20～200 μL，艾本德中国有限公司)；SC-3610低速离心机(安徽中科中佳科学仪器有限公司)；电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)；高速万能粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司)；YP3002电子天平(上海佑科仪器仪表有限公司)；PHS-3D型实验室pH计(上海三信仪表厂)。

2.3 试验方法

2.3.1 辣木叶中蛋白质超声提取工艺流程

准确称取上述任意辣木叶粉样品1.00 g放入250 mL烧杯中，加入特定pH特定量的超纯水，超声提取。将超声处理后的固、液混合物分批次移入50 mL离心管中，5000 r/min离心10 min，合并上清液，测定上清液中蛋白质含量，于4 ℃冰箱中保存。

2.3.2 辣木叶中蛋白质含量测定

蛋白质测定方法参考考马斯亮蓝G-250法[20]。以牛血清蛋白绘制蛋白质测定标准曲线，根据光度和标准曲线计算辣木样品中蛋白质含量，根据下述公式计算蛋白质提取率，计算公式为：

蛋白质提取率%=

2.3.3单因素试验对辣木叶中蛋白质提取率的影响

固定溶剂pH值、料液比、提取温度、超声功率和提取时间5种因素中的4种，在合理范围内考察单因素对辣木叶中蛋白质提取率的影响。其中pH值的考察范围为8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、10.5、11.0；料液比的考察范围为1∶40(g/mL)、1∶60(g/mL)、1∶80(g/mL)、1∶100(g/mL)、1∶120(g/mL)、1∶140(g/mL)、1∶160(g/mL)；超声功率的考察范围为40 W、45 W、50 W、55 W、60 W、65 W、70 W，提取温度的考察范围为25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃；超声提取时间的考察范围为10 min、20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min。

2.3.4 响应面法分析试验

在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken试验设计原理，运用Design Expert 8.0.6软件，以溶剂pH、料液比、超声功率、提取温度、超声时间5个因素为自变量，3个水平的方式进行正交试验，以辣木叶中蛋白质的提取率为指标，考察各因素的影响水平，对其提取工艺进行优化。

3 结果与分析

3.1 单因素试验对辣木叶中蛋白质提取率的影响

3.1.1 溶剂 pH的影响

溶剂pH值对辣木叶中蛋白质提取率的影响如图1a所示，当溶剂pH值在8.0～10.0范围内逐渐升高时，蛋白质的提取率不断提高；溶剂pH为10.0时蛋白质提取率达到最大值35.7%，继续增加溶剂pH，蛋白质提取率下降。这可能因为当pH在8.0～10.0范围内逐渐升高时，随着碱浓度的逐渐增大，溶液中蛋白质上较多的氨根离子呈现电离状态，得到的游离蛋白质逐渐增多，提取率提高；当pH大于10.0的时候蛋白质发生变性，导致蛋白出现脱氨、脱羧反应，产生蛋白沉淀，从而降低了蛋白质的提取率。实验溶剂pH选用10.0。

料液比对辣木叶中蛋白质提取率的影响如图1b所示。当料液比从1∶40 (g/mL)增加至1∶120 (g/mL)时，随着溶剂量的逐渐增加，蛋白质提取率逐渐上升；当料液比等于1∶120 (g/mL)时蛋白质提取率达到最大值38.3%；继续增加溶剂的量，蛋白质提取率并未出现太大变化。这可能是因为当液料比为1∶120 (g/mL)时植物细胞中蛋白质已经全部溶出，继续提升溶剂的量对于蛋白质的提取率并无影响。后续实验选用1∶120 (g/mL)的料液比。

超声功率对辣木叶中蛋白质提取率的影响如图1c所示。当超声功率在40 W～50 W之间逐渐升高时，蛋白质提取率急剧升高；当超声功率等于60 W时蛋白质提取率达到最大值38.3%；当超声功率大于60 W时，蛋白质提取率降低。这可能因为当功率在40 W～50 W之间逐渐升高时，植物细胞壁被破坏，蛋白质容易从细胞内部溶出，但当超声功率较大时，空化气泡没有足够的时间破裂，空化效率降低，提取率下降[21]，从而降低蛋白质回收率。后续实验选用超声功率50 W。

超声提取温度对辣木叶中蛋白质提取率的影响如图1d所示。当温度从25℃升至50℃时，蛋白质提取率不断上升；提取温度为50℃时蛋白质的提取率达到最大值40.3%；继续提高温度，蛋白质提取率下降。这可能因为当温度从25℃升至50℃时，蛋白质在水中的溶解度逐渐增大；当温度继续上升，蛋白质发生变性，形成大分子聚集体，从而降低了提取率[22]。后续实验选用50℃。

图1 各影响因素对辣木叶中蛋白质提取率的影响(a).pH值影响；(b).料液比影响；(c).超声功率影响；(d).提取温度影响；(e).提取时间影响

超声提取时间对辣木叶中蛋白质提取率的影响如图1e所示。当提取时间从10 min-50 min逐渐增加时，蛋白质提取率逐渐增加；50 min时蛋白质提取率最大值42.4%；当提取时间大于50 min时，提取率有小幅下降。这可能因为当提取时间在10 min-50 min之间时，随着时间的增加蛋白质溶出量逐渐增加；当时间大于50 min，随着提取时间的延长，细胞内的蛋白降解酶也随之溶出，这些蛋白降解酶降解了部分溶出的蛋白[23]，降低了蛋白的提取率。后续实验选用超声时间50 min。

综上所述，经单因素试验优化后得到的最佳工艺为：溶剂pH 10.0，料液比1:120 (g/mL)，超声功率50 W，提取温度50 ℃，超声时间50 min。

3.2 Box-Behnken模型对辣木中蛋白质提取率的优化

在单因素试验与分析的基础上，考察最优的实验条件。以5因素3水平的方式进行正交试验如表1所示。采用Design Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken模型对试验进行设计，以蛋白质提取率为指标，软件所给出的试验方案以及测得的实验结果如表2所示；多元回归模型方差分析如表3所示。

表1 L46(35)试验因素及水平

表2 Box-Behnken试验方案及测得的试验结果

续表2

通过Dsign Expert 8.0.6对表2中数据的拟合，得到辣木叶中蛋白质提取率Y对A、B、C、D、E的二元多次回归方程为：

Y=42.45+0.78A+0.19B+0.32C-0.14D+0.36E-0.025AB-0.17AC+0.000AD-0.025AE+0.050BC+0.000BD+0.075BE+0.000CD+0.000CE-0.025DE-1.78A2-1.20B2-1.24C2-1.46D2-0.56E2

表3 多元回归模型方差分析结果

注：*为P<0.01，显著。

由表3可知，失拟项为1.47，说明该模型拟合度良好，能够对实验结果进行准确预测。A、B、C、D、E、AC、A2、B2、C2、D2、E2对辣木叶中蛋白质提取率影响显著。从F值的大小可以看出，对辣木叶中蛋白提取率有影响的5个因素中，影响的大小顺序为：A>E>C>B>D，即pH值>提取时间>超声功率>料液比>提取温度，其中pH值和提取时间两个因素对辣木叶中蛋白提取率的影响最为显著。

3.3 最佳提取工艺及验证

通过Dsign Expert 8.0.6软件中Box-Behnken模型对实验数据的分析，得到最佳提取条件为：pH值10.1、料液比1∶121.8 (g/mL)、提取功率50.6 W、提取温度49.7 ℃、提取时间53.2 min，辣木叶中可溶性蛋白提取率的预测值为42.6%。实际实验设计中，取100 g辣木叶干粉、pH值选用10.0、料液比选用1∶122 (g/mL)、超声功率选用51 W、提取温度选用50 ℃、提取时间选用53 min，进行放大性实验，得到的辣木叶中蛋白的真实回收率为42.3%，与理论预测值的偏差较小，说明利用响应面分析法优化得到的辣木叶中蛋白质的提取条件可靠。

3.4 市售辣木叶中蛋白质含量比较

采用以上最佳提取工艺对从云南、广东、广西、福建、四川等不同产区随机抽样的26个辣木叶干品、19个辣木粉样品、31个辣木茶样品进行蛋白质提取处理，对各样品中的蛋白质提取率进行分析，结果如表4和图2中所示。其中辣木叶干品样品中测得蛋白质提取率最小值为21.0%，最大值为38.1 %，平均值为27.7%；辣木粉样品中测得蛋白质提取率最小值为19.9%，最大值为35.5%，平均值为27.0%；辣木茶样品中测得蛋白质提取率最小值为12.9%，最大值为34.4%，平均值为28.3%。所有辣木叶产品中蛋白质含量都在10%以上，90%以上产品的蛋白质含量都在20%以上，说明辣木叶中的蛋白质非常高，可以作为植物蛋白的替代来源。

表4 辣木叶干品、辣木粉样品、辣木茶样品中蛋白质提取率

续表4

续表4

图2 辣木叶产品中蛋白质提取率对比率

4 结论

结合超声提取法和响应面法对辣木原料及其相关种产品中的蛋白质的提取条件进行了分析研究，发现pH值、提取时间、超声功率、料液比和提取温度等因素对蛋白质提取率的影响依次降低，其中pH值和提取时间两个因素对辣木叶中蛋白质提取率的影响最为显著。最佳的提取条件为pH值10.0、料液比1∶122 (g/mL)、超声功率51 W、提取温度50 ℃、提取时间53 min，此时得到的辣木叶中蛋白的真实回收率为42.3%，与理论预测值的偏差较小，说明利用Box-Behnken模型优化得到的辣木叶中蛋白质的提取条件可靠。本文将理论和实验相结合，避免了重复实验，降低了实验工作量，提升了实验效率。最后对辣木原料及其相关产品中得蛋白质进行了提取和测定，进一步证明了辣木叶中的蛋白质含量很高，为现有辣木相关产品的深度开发和利用提供了应用技术支持。